用气相色谱法测定血液制品生产过程中中间品乙醇的含量

盛凤仙，李 萍

(上海新兴医药股份有限公司,上海 200135)

目前，上海新兴医药股份有限公司采用国际先进的低温乙醇压滤法(Cohn法)[1-2]制备人血白蛋白等血液制品,该工艺生产过程中要求严格控制五大关键参数，分别是温度、pH、离子强度、蛋白浓度和乙醇浓度，对前4个参数都已建立了检测方法，并且进行了测定，而乙醇浓度采用称重法计算而得,该法误差相对较大，会影响到产品的纯度和得率。为了更好地控制产品质量，确保生产出持续稳定的符合药品质量标准和注册要求的产品，配合工艺验证的需求，笔者参考有关文献[3-5]，利用气相色谱法对血液制品生产过程中中间品乙醇的含量测定方法进行了探讨。

1 材料

1.1 仪器与试药

安捷伦6890N气相色谱仪；无水乙醇(AR级，国药集团化学试剂有限公司，含量≥99.7%)；正丙醇(AR级，国药集团化学试剂有限公司，含量≥99.0%)；钨酸钠(AR)；硫酸(AR)；10%钨酸钠溶液(取钨酸钠10 g，加注射用水定容至100 ml)；0.33 mol/L硫酸溶液(取硫酸1.86 ml 缓缓注入适量注射用水中，放冷，定容至100 ml)，样品由研究部提供(8%乙醇蛋白溶液，批号：ALB 20170119；20%乙醇蛋白溶液，批号：ALB 20170119；40%乙醇蛋白溶液，批号：ALB 20170119)。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密吸取平衡至室温的1.0 ml样品溶液置于10 ml容量瓶中，精密加入0.2 ml正丙醇内标溶液，再加入1 ml 10%钨酸钠溶液和1 ml 0.33 mol/L硫酸溶液，用注射用水定容至刻度，混匀，静置30 min后，用0.45 μm水溶性膜过滤，备用。

2.2 色谱条件

色谱柱：DB-624毛细管色谱柱(0.25 mm ×30 m,1.4 μm)；FID检测器；气化室温度230℃；检测器温度280℃；柱温：40℃保持5 min后，以10℃/min升温至80℃，再以50℃/min升温至230℃，保持3 min；柱流量：1 ml/min；空气：400 ml/min；氢气：40 ml/min；分流比100∶1；进样量0.5 μl。

2.3 专属性试验

精密吸取不含乙醇的含蛋白0.1%的空白溶液1.0 ml置于10 ml容量瓶中，不加正丙醇内标，加入1 ml 10%钨酸钠溶液和1 ml 0.33 mol/L硫酸溶液，用注射用水定容至刻度,混匀,静置30 min后用0.45 μm水溶性膜过滤，取0.5 μl按 “2.2” 项下色谱条件测定，记录色谱图(图1)；另外，分别取按“2.5”项下方法制备的对照品溶液和按“2.1”项下方法制备的供试品溶液0.5 μl，同样按 “2.2” 项下色谱条件测定，记录色谱图(图2、图3)。从图1可见，没有色谱峰出现，说明处方中其他成分对乙醇含量测定无干扰；从图3可见，乙醇峰与正丙醇峰完全分离，分离度大于1.5，互不干扰，专属性好。

图1 空白溶液色谱图

图2 对照品溶液色谱图1.乙醇；2.正丙醇内标

图3 供试品溶液色谱图1.乙醇；2.正丙醇内标

2.4 系统适用性试验

从图2可知，乙醇峰与正丙醇内标峰保留时间分别约为4.4 min和7.5 min；乙醇峰与正丙醇内标峰分离度为41.07，乙醇峰理论塔板数为54 888，均符合《中国药典》要求。

2.5 线性关系考察

精密量取无水乙醇对照品0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 ml，分别置于已预先加入适量注射用水的10 ml容量瓶中，再向各对照品容量瓶中精密加入0.20 ml正丙醇内标溶液,用注射用水定容至刻度，混匀，按“2.2”项下色谱条件测定，记录峰面积。以各乙醇对照品峰面积与正丙醇峰面积之比(X)，对乙醇对照品溶液浓度(Y，%)绘制曲线，得线性回归方程为Y=2.728 5×10-3X+ 2.569 8，r=1.000 0。结果表明，乙醇对照品浓度在0.5%～5%范围内，乙醇对照品峰面积与正丙醇峰面积之比呈良好的线性关系。

2.6 回收率试验

精密量取3.20、4.00、4.80 ml无水乙醇对照品，分别置于已预先加入适量不含乙醇0.1%蛋白溶液的10 ml量瓶中，用不含乙醇0.1%蛋白溶液定容至刻度，混匀后即得32.0%乙醇蛋白溶液、40.0%乙醇蛋白溶液、48.0%乙醇蛋白溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，并按 “2.2” 项下色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率，结果详见表1。

表1 乙醇回收率试验结果(%，n=9)

2.7 精密度试验

取按“2.5”项下方法制备的对照品溶液，并按 “2.2” 项下色谱条件操作，连续测定5次，记录峰面积，结果乙醇对照品峰面积与正丙醇内标峰面积之比(X)的RSD为0.16 %，表明精密度良好。

2.8 稳定性试验

取8%乙醇蛋白溶液(批号：ALB20170119)，按

“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别在0、4、8和12 h按 “2.2” 项下色谱条件测定，记录峰面积，结果表明乙醇对照品峰面积与正丙醇内标峰面积之比分别为0.317 1、0.317 3、0.317 6、0.317 3，RSD为0.06%，表明处理后样品在12 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验

取同一批(批号：ALB20170206)40%乙醇蛋白溶液样品6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，并按 “2.2” 项色谱条件检测，记录峰面积，结果样品中乙醇含量分别为39.00%、39.31%、39.38%、39.43%、39.36%、39.46%，平均含量为39.32%，RSD为0.42%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.10 样品含量测定

分别取同一批样品(批号：ALB20170119)而含不同浓度(8%、20%、40%)乙醇的蛋白溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，并按 “2.2”项色谱条件测定，记录峰面积，以线性回归方程计算得到供试品中乙醇含量，结果均符合要求，详见表2。

表2 样品中乙醇含量测定结果(n=2)

3 讨论

3.1 系统适用性试验

本实验条件下，在空白溶液色谱图中未见色谱峰出现，无其他杂质峰出现，专属性好；在本实验的典型图谱中，乙醇与内标正丙醇相邻两峰完全分开，分离度大于2，乙醇峰理论塔板数大于10 000，符合药典要求。

3.2 实验注意事项

实验中应注意：必须用校正过的移液器，以确保加入内标正丙醇的量准确，混合必须充分均匀，沉淀蛋白必须完全，这样才能确保实验顺利进行和结果的准确性。

3.3 本法优点

本法以正丙醇作为内标，与其他方法(如比色法)[6-8]相比，具有操作简单、方法灵敏、测定结果准确可靠、重复性好等优点，可用于血液制品生产过程中对中间品乙醇含量的测定。