基于正交投影偏最小二乘法对复方首乌藤合剂抗失眠作用的谱效关系研究

曾棋平，蔡小辉，吴坤林，杨丽娜，曹毅祥，陈锦珊

(中国人民解放军联勤保障部队第九○九医院/厦门大学附属东南医院制剂科，福建 漳州,363000)

中药制剂具有高度的复杂性，通过多成分、多途径、多靶点发挥药效作用。中药的整体药效是制剂中所含的“药效物质成分群”综合作用的结果[1-3]。当前，在众多的中药质量控制方法中，指纹图谱切实可行且被国内外广泛认可。然而，药效活性成分并不一定是指纹图谱所体现的化学成分，含量高并不等于活性高。因此，单纯的指纹图谱还不能准确全面评价中药的成分与药效之间的相关信息，存在一定的局限性[4]。近年来，谱效关系学已成为中药研究的新领域[5-6]。中药谱效关系就是以中医药理论研究为基础，通过指纹图谱与药效之间的相互关系揭示中药所含化学成分与药效之间的相关性，最终确定相应的药效物质基础，使构建的指纹图谱用于中药质量控制更具有针对性。

复方首乌藤合剂为厦门大学附属东南医院特色制剂，主要由首乌藤、合欢皮、五味子、蔓荆子、续断、川芎、菟丝子、煅牡蛎八味药材组成，具有清心安神、滋阴清肝、活血行气、祛风止痛等功效，临床上用于治疗神经衰弱性失眠[7-9]。虽该方临床功效确切，但其整体复方的药效成分群以及配伍的现代科学依据仍未阐明。本实验研究复方首乌藤合剂的指纹图谱与抗失眠作用，采用正交投影偏最小二乘法(orthogonal partial least square，OPLS)对两者进行相关性分析，旨在寻找对抗失眠贡献较大的药效成分群，初步阐明该复方配伍的科学依据，以便更好地对其进行质量控制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪(DAD检测器，美国Agilent公司)；BT224S型电子分析天平(精度：0.1 mg，德国赛多利斯集团)；PHS-3C型pH计(杭州雷磁分析仪器厂)；RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；H1650R高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；680型酶标测试仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 药物与试剂

对照品：五味子醇甲(批号：110857-201513，质量分数99.9%)、绿原酸(批号：110753-200413，质量分数99.9%)、盐酸川芎嗪(批号：817-200104，质量分数99.9%)，均购自中国食品药品检定研究院；二苯乙烯苷(批号：GZDD-0506，质量分数98%)、合欢皮木脂素苷(批号：GZDD-0817，质量分数98%)、阿魏酸(批号：GZDD-0022，质量分数99%)、川续断皂苷Ⅵ(批号：GZDD-0006，质量分数98%)，均购自贵州迪大生物科技有限责任公司。药材：首乌藤PolygonimultifloriCaulis(PMC，批号：20150828，产地：湖北)为蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥藤茎，合欢皮AlbiziaeCortex(AC，批号：20170214，产地：湖北)为豆科植物合欢AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥树皮，菟丝子Cuscutaesemen(CS，批号：20160320，产地：内蒙)为旋花科植物南方菟丝子CuscutaaustralisR.Br.或菟丝子CuscutachinensisLam.的干燥成熟种子，牡蛎(煅)Ostreaeconcha(OC，批号：20150605，产地：浙江)为牡蛎科动物长牡蛎OstreagigasThunberg大连湾牡蛎OstreatalienwhanensisCrosse或近江牡蛎OstrearivularisGould的贝壳，蔓荆子Viticisfructus(VF，批号：20150102，产地：江西)为马鞭草科植物单叶蔓荆VitextrifoliaL.var.simplicifoliaCham.或蔓荆VitextrifoliaL.的干燥成熟果实，续断Dipsaciradix(DR，批号：20161107，产地：四川)为川续断科植物川续断DipsacusasperWall.ex Henry的干燥根，均购自福建尤溪仙锦药业有限公司；五味子SchisandraechinensisFructus(SCF，批号：201702374，产地：辽宁)为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果实，川芎Chuanxiongrhizoma(CR，批号：201703358，产地：四川)为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，均购自樟树市庆仁中药饮片有限公司；DL-4-氯苯丙氨酸[批号：A13323，阿法埃莎(中国)化学有限公司]；0.9%氯化钠注射液(100 ml/袋，自制)；碳酸氢钠(批号：180425，上海虹光化工厂)；地西泮片(规格：2.5 mg，上海信谊药厂有限公司)；聚山梨酯-80(批号：180801，四川金山制药有限公司)，羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；大鼠5-羟色胺试剂盒(上海极威生物科技有限公司)；乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为纯化水。

1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，72只，体重(180±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物使用许可证号：SCXK(沪)2012-0002。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取盐酸川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、二苯乙烯苷、合欢皮木脂素苷、川续断皂苷Ⅵ、五味子醇甲对照品适量，精密称定，加甲醇制成混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

称取首乌藤18.75 g、合欢皮12.5 g、五味子4.17 g、蔓荆子 4.17 g、续断12.5 g、川芎7.5 g、菟丝子12.5 g、煅牡蛎9.44 g，按表1的设计进行回流提取，提取溶剂为水，最终均加水制成100 ml，摇匀，即得样品溶液。精密量取样品溶液5 ml，置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得，分别标记为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9。

表1 复方首乌藤合剂样品制备工艺的正交试验分析

2.3 指纹图谱的建立

2.3.1色谱条件

色谱柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0～10 min，2%～3%乙腈；10～35 min，3%～9%乙腈；35～50 min，9%～13%乙腈；50～65 min，13%～18%乙腈；65～85 min，18%～25%乙腈；85～100 min，25%～35%乙腈；100～107 min，35%～65%乙腈；107～118 min，65%～90%乙腈；118～120 min，90%～2%乙腈；流速：1.0 ml/min；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μl。

2.3.2方法学考察

取“2.2”项下供试品溶液(S5)，按“2.3.1”项下条件连续进样6次，记录色谱图，结果各色谱峰相对保留时间和峰面积的RSD均<1.0%，表明仪器精密度良好。取“2.2”项下同一供试品溶液(S5)，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h按“2.3.1”项下条件进样，记录色谱图，结果各色谱峰相对保留时间和峰面积的RSD均<3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。从同一提取液(S5)中按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.3.1”项下条件测定，结果各色谱峰相对保留时间和峰面积的RSD均<5%，表明该方法重复性良好。

2.3.3指纹图谱的建立及色谱峰的确定

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)软件，以表1中S5样品的色谱图为参照谱，时间窗口设为0.5 min，选择各图谱中均含有且峰形相对好的色谱峰进行多点校正，运用平均数法生成对照图谱。结果从9张图谱中筛选了21个特征峰(X0～X20)作为研究对象(图1)，复方首乌藤药材指纹图谱色谱峰匹配数据见表2。

图1 复方首乌藤合剂的HPLC指纹谱及其对照指纹谱(R)

峰面积样品组S1S2S3S4S5S6S7S8S9X05487.588985.559962.618966.26469.327462.19780.638794.18794.1X12875.512855.395281.474577.354457.532936.374036.423439.973439.97X2896.651145.691240.841242.88832.75943.851121.931020.251020.25X31457.252623.12713.52281.191516.642254.123437.722444.992444.99

(续表2)

2.4 酶联免疫吸附法测定大鼠海马体5-HT的含量

2.4.1DL-4-氯苯丙氨酸混悬液的制备

处方：DL-4-氯苯丙氨酸(PCPA)15 g，聚山梨酯80 2.0 g，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)3.0 g，0.9%氯化钠注射液(pH7～8)加到500 ml。

制法：量取0.9%氯化钠注射液500 ml于烧杯中，缓慢滴加5%碳酸氢钠溶液，用pH计调节pH在7～8之间，加入CMC-Na，搅拌均匀，继续加入处方量的PCPA和聚山梨酯-80，超声15 min，于搅拌状态下分装于耐高温的玻璃瓶内，盖塞轧口密封，100℃流通蒸汽灭菌30 min。

2.4.2供试品溶液的制备

取“2.2”项下的9组复方首乌藤合剂各100 ml，分别浓缩至约80 ml，即得浓度(含生药量)为1.0 g/ml的供试品溶液，于4℃保存备用。

2.4.3地西泮溶液的制备

取地西泮片剂10片，研磨成粉末，加纯化水适量，充分搅拌使溶解，转移至100 ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，即得浓度为0.25 mg/ml的阳性对照液。

2.4.4动物分组、造模及给药

将72只SPF级SD大鼠，随机分为12组，分别为正常组、模型组、阳性对照组、9批复方首乌藤合剂组，每组6只。大鼠适应性喂养7 d后，除了正常组外，对其余各组大鼠进行腹腔注射PCPA(300 mg/kg)制作失眠模型，每日1次，连续2 d，在第1次腹腔注射PCPA的48 h后，大鼠出现白昼萎靡不振、食欲降低。而夜间活动频繁、兴奋性增高、易激惹且攻击性增强，对外界的声光等刺激异常敏感。此外，大鼠尾部多处出现撕咬痕迹且破损出血，昼夜节律紊乱，表明造模成功。于第10天进行灌胃给药，正常组和模型组给予适量的生理盐水，阳性对照组和不同批次的复方首乌藤组给药量分别为4.2 ml/kg和6.8 ml/kg，每天给药1次，连续7 d。

2.4.5海马体取材和含量测定

将大鼠放入装有浸润乙醚(乙醚量为1～1.5 ml)棉球的标本缸内，观察大鼠情况，待大鼠进入麻醉期后，处死，固定于自制的手术木板置于解剖盘中，开胸暴露并游离出心脏，经左心室插入灌流针并固定，切开右心耳，先灌注无菌生理盐水(4℃)，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清，再灌注4%多聚甲醛(4℃)，断头取脑，冲净血液后，在冰上分离出各组大鼠的海马组织，并称重，将组织进行匀浆，于高速冷冻离心机离心(5 000×g)10 min，取上层清液，置于-80℃冰箱中保存，备用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行5-羟色胺(5-HT)的测定，实验步骤按照试剂盒具体要求进行操作，用酶联免疫检测仪在吸收波长450 nm处测得光密度(OD)值，复方首乌藤合剂镇静催眠药效值为各组大鼠海马体中5-HT的含量，结果见表3。

表3 各组失眠大鼠海马体中的5-HT含量

*P<0.05，与模型组比较

2.5 谱效关系的偏最小二乘回归分析

2.5.1偏最小二乘回归方程的建立

以标准化处理的指纹图谱中各特征峰峰面积为自变量X，以各组失眠大鼠海马体中的5-HT含量水平为因变量Y，采用SIMCA-P 14.1软件对其进行OPLS回归分析，结果见图2，得方程：

Y=0.064 0X0+0.086 7X1+0.052 4X2-0.025 3X3-0.051 6X4-0.078 6X5+0.038 4X6+0.094 5X7+ 0.066 0X8- 0.018 3X9+ 0.066 1X10-0.067 8X11+0.050 8X12-0.124 5X13+0.010 4X14-0.061 4X15-0.077 4X16-0.032 8X17-0.101 0X18+0.001 3X19+0.019 0X20

式中,系数越大表明该自变量对药效影响越大，并且系数为正值说明其与药效呈正相关，负数则表示与药效呈负相关。

2.5.2变量投影重要性分析

变量投影重要性(variable importance in projection，VIP)是反映自变量对因变量解释能力的1个重要指标，其值越大说明该自变量对因变量的解释能力越强。一般认为，当VIP值>1时，自变量在解释因变量时具有显著重要性，VIP分析结果见图3。OPLS回归分析结果表明X1、X4、X5、X8、X9、X10、X12、X13、X14、X15、X16和X18的VIP值均>1，排序为X8>X16>X12>X5>X18>X1>X9>X15>X4>X10>X13>X14，其中X1、X10、X12、X14与5-HT含量水平呈正相关，而X1、X10、X12的VIP值较大，当它们含量增加时，复方首乌藤合剂提高5-HT水平的能力则会显著增强；X4、X5、X8、X9、X13、X15、X16、X18与5-HT水平呈负相关，X8、X16、X5、X18的回归系数和VIP绝对值均较大，当它们含量增加时，复方首乌藤合剂提高5-HT水平的能力则会减弱。

图2 复方首乌藤合剂抗失眠谱效相关性的PLSR模型回归系数

图3 各特征峰对复方首乌藤合剂抗失眠活性的VIP贡献

2.5.3色谱峰的成分鉴定

采用已有对照品进行HPLC分析，匹配出X4为盐酸川芎嗪，X8为绿原酸，X11为阿魏酸，X12为二苯乙烯苷，X13为合欢皮木脂素苷，X17为川续断皂苷Ⅵ，X19为五味子醇甲，见图4。

图4 混合对照品的HPLC图 X4.盐酸川芎嗪；X8.绿原酸；X11.阿魏酸；X12.二苯乙烯苷；X13.合欢皮木脂素苷；X17.川续断皂苷Ⅵ；X19.五味子醇甲

3 讨论

中药组分复杂，其疗效的发挥为多成分、多靶点、多途径协调作用的结果，单一或几个化学成分的定量检测难以全面评价中药质量的优劣。谱效关系研究实际上是数学相关分析与药学的一个交叉应用，如何进行谱效关系研究尚未有统一的认识和适用模式。分析方法主要有最小二乘法分析、灰色关联度分析、聚类分析等[10-12]。本试验采用的正交投影偏最小二乘法是一种改进的偏最小二乘法，能有效去除预测矩阵中与因变量无关的信息，改善了模型的解释性和真实性[13]。研究结果显示，复方首乌藤合剂抗失眠作用中有12个成分较为重要，也解释了该合剂抗失眠作用并非某一具体成分的药效，而是多成分协同起效的结果。

本实验选用乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相，采用梯度洗脱方式，所得的HPLC图谱基线平稳，共有色谱峰数目较多，各主要成分峰分离度较好。采用DAD检测器在190～400 nm范围内进行全波长扫描，发现波长在210 nm时色谱峰数量较多，整体图谱较为匀称，因此将210 nm作为检测波长。

由于5-HT是一种重要的中枢神经递质，参与多种行为情绪活动尤其是睡眠的调节，大鼠腹腔注射PCPA后，可选择性地阻断脑内5-HT的合成。PCPA诱导的大鼠失眠模型具有造模时间短、经济、简便易行、造模成功率高、病变典型、重复性高等优点，是国内外较为公认的失眠模型[14]。因PCPA溶解度差，直接采用弱碱性生理盐水(pH7～8)溶解会导致混悬液易沉降、注射剂量不准确、堵塞注射器等问题。本研究在参考相关文献的基础上[15]，通过添加聚山梨酯-80和CMC-Na等助悬剂，配制的PCPA混悬液微粒大小均匀、沉降速度慢，具有良好的再分散性。

中药指纹图谱可以反映药材多种化学成分的整体性差异，而生物评价既关联临床功效又关联机制。因此，将化学指纹图谱与生物活性评价相结合，构建基于化学指纹图谱与药效的综合评控模式有利于对中药制剂进行更合理的评控[16]。通过基于谱效相关性的研究，课题组发现复方首乌藤合剂中的3个成分对其抗失眠作用贡献度较高，初步探讨了其抗失眠的物质基础。然而，通过对照品匹配，仅指认出7个色谱峰，与活性显著相关的色谱峰指认出1个(二苯乙烯苷)，在后续研究中，将通过Q-TOF或LC-MS/MS等研究手段对未知色谱峰进行结构鉴定，以进一步明确复方首乌藤合剂中与抗失眠活性相关的活性成分。