hsa-miRNA-30a-5p促进肺癌细胞A549增殖的机制研究

周 静，吴 杲,马福家

(1.宁波市妇女儿童医院，浙江 宁波，315012；2.海军军医大学附属长海医院虹口院区,上海 200081；3.海军特色医学中心药剂科，上海 200052)

我国每年新发现肺癌病例数约为70万[1]，而肺癌致死率已上升至恶性肿瘤病死率的首位[2]，寻找新的潜在肺癌基因治疗靶点，开发更为有效的肺癌治疗方案，已成为关乎全民健康的迫切问题。hsa-miRNA-30a-5p定位于人6号染色体，其家族与肿瘤的相关报道多集中于肝癌及乳腺癌研究领域。A类清道夫受体5-SCARA5，位于8号染色体短臂，被称为“低调的抑癌高手”。SCARA5在肝癌、宫颈癌和乳腺癌的发生发展中扮演着重要角色，与这些类型的肿瘤侵袭和迁移也有密切的关系[3]。但与肺癌的相关研究未见有相关报道。在本研究中，我们拟对临床肺癌标本中的hsa-miRNA-30a-5p 和SCARA5表达及相关性做出检测和分析，用低通量方法做进一步验证hsa-miRNA-30a-5p与SCARA5的表达差异，同时分析两者的相关性，在此基础上，我们通过生物信息学分析hsa-miRNA-30a-5p 和SCARA5基因3′-UTR区的结合关系，并通过荧光素酶报告基因法进行证实，最终拟通过干预A549细胞内hsa-miRNA-30a-5p含量来调控肿瘤细胞增殖活性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人肺癌标本及癌旁组织取自解放军第455医院，人肺癌A549细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，RPMI1640培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000转染试剂、RNA提取试剂盒(Trizol)及反转录试剂盒(M-MLV)均购自美国Invitrogen公司，荧光素酶报告基因表达载体(PGL3-promoter)和荧光素酶检测系统(Promega公司)，SCARA5蛋白一抗及二抗均购自美国Santacruz公司，细胞及组织总蛋白提取及定量试剂盒、化学发光试剂盒均购自美国Thermo公司，miRNA合成及测序均由上海生工工程有限公司进行，MTT(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司，无内毒素质粒DNA提取试剂盒(Qiagen公司)，荧光定量检测试剂盒、限制性内切酶、连接酶、切胶回收试剂盒均购自Takara公司,pshRNA基因沉默表达载体(美国Systermbio公司)。

1.2 仪器和设备

细胞培养箱(美国Thermo公司)，水平离心机、高速低温离心机以及微量移液器(Eppendorf公司)，电泳仪、垂直电泳槽及转膜仪(上海天能公司)，酶标仪及紫外分光光度检测仪(Thermo公司)，PCR仪(BioRad公司)。

2 实验方法

2.1 肺癌标本中hsa-miRNA-30a-5p及SCARA5

蛋白含量检测

收集肺腺癌及其癌旁组织5对，组织取好之后用生理盐水漂洗，后用滤纸吸干水分，然后将组织装入冻存管，编号后液氮保存。开始检测实验前，取出液氮保存的组织样本，切取2份各200 mg左右的组织，每份组织加入1 ml经4℃预冷的Trizol，使用电动匀浆器进行组织匀浆，匀浆液4℃下以12 000×g离心2 min，收集上清液，然后酚氯仿法提取组织Total RNA。RNA通过琼脂糖凝胶电泳观察完整性，并通过紫外分光光度仪检测RNA浓度。取2 μg RNA经M-MLV反转录制备cDNA，荧光定量法检测组织中hsa-miRNA-30a-5p含量。另取相同大小组织，加入1 ml组织裂解液T-MER，经充分匀浆后进行组织蛋白提取和定量，实验过程完全按照试剂盒说明书进行，蛋白提取完成后，通过Western blotting检测组织中SCARA5蛋白相对含量。

2.2 生物信息学预测hsa-miRNA-30a-5p与SCARA5

(NM_173833.5) 3′-UTR结合位点

采用Targetscan预测软件对SCARA5(NM_173833.5) 3′-UTR区与hsa-miRNA-30a-5p进行结合位点预测，预测结果显示(图2A)，hsa-miRNA-30a-5p在SCARA5的3′-UTR区存在8个碱基的种子区“5′-UGUUUACA-3′”。

2.3 载体构建

化学法合成长链DNA，5′-CTAGATGCATTTCAGGGACTGCATTTCAGGGAC TGCATTTCAGGGAC-3′，下游引物，5′-AGATC GTCCCTGAAATGCAGTCCCTGAAATGCAGTCCCTGAAATGCA-3′，两端分别添加XbaⅠ酶切位点，片段包含hsa-miRNA-30a-5p与SCARA5基因3′UTR区结合位点，长链退火形成双链DNA，后克隆至荧光素酶报告基因表达载体PGL3-promoter，重组载体经序列分析后命名为野生型荧光素酶报告基因表达载体pGL3-WT-SCARA5。使用同样的方法将预测结合位点进行错义突变，即由“5′-UGUUUACA-3′”突变为“5′- AUUCUGUA-3′”，构建突变型荧光素酶报告基因表达载体pGL3-MT-SCARA5，根据SCARA5(NM_173833.5)的基因信息，设计针对其编号取的siRNA序列5′-GCAACGCCAGCGAGGACAC-3′,然后根据siRNA序列设计两条互补的长链DNA，上下游引物分别添加酶切位点BamHΙ和EcoRΙ及保护碱基，上游引物序列：5′- GATCCGCAACGCCAGCGAGGACAC CTTCCTGTCAGAGTGTCCTCGCTGGCGTTGCTTTTTG -3′；下游引物序列：5′- AATTCAAAAAGCAACGCCAGCGAGGACAC TCTGACAGGAAG

GTGTCCTCGCTGGCGTTGCC -3′，双链DNA经退火形成双链DNA，并克隆至基因表达载体，构建SCARA5基因表达载体pshRNA- SCARA5。 重组载体经序列分析无误后，扩增转化菌株，进行无内毒素质粒DNA提取，提取过程严格按照试剂盒说明书进行，使用dH2O将质粒DNA终浓度调整至500 ng/μl,-20℃保存。

化学合成miRNA-30a-5p mimics(5′ -uGuAAACAuCCuCGACuGGAAG-3′),inhibitor(5′-CuuCCAGuCGAGGAuGuuuACA-3′)及阴性对照(NC,5′-CuuCCAGuCGAGGAuGuuuACA- 3′),RNA末端加tt保护碱基。

2.4 Hsa-miRNA-30a-5p与SCARA5靶位关系的验证

选取对数生长期的A549细胞，胰酶消化法制备细胞悬液，台酚蓝染色后使用血细胞计数板进行活细胞计数，使用完全培养基(RPMI1640+10%FBS)调整细胞密度为1×105个/ml，接种细胞于6孔板，每孔加2 ml细胞悬液，37℃和5% CO2条件下培养24 h，参照Lipofectmaine 2000转染试剂说明书进行质粒和RNA共转染实验。转染分为9组：A549对照组、pGL3-WT-SCARA5组、pGL3-MT-SCARA5组、miRNA30a-5p NC+pGL3-WT-SCARA5组、miRNA30a-NC+ pGL3-MT-SCARA5组、miRNA30a-5p mimics+pGL3-WT-SCARA组、miRNA30a-5p mimics+pGL3-MT-SCARA组、miRNA30a-5p inhibitor+pGL3-WT-SCARA组和miRNA30a-5p inhibitor+pGL3-MT-SCARA组，每组细胞转染100 ng的海肾荧光素酶表达质粒(pGL3-TK)作为荧光霉素活性的检测参照。A549细胞转染后48 h，使用Promega公司的双荧光素酶检测系统和荧光素酶检测仪，检测转染后细胞荧光素酶活性。

2.5 转染miRNA30a-5p inhibitor对肺癌A549的影响

取对数生长期的A549细胞，0.25%胰酶消化后收集细胞，1 500×g水平离心2 min，收集细胞，使用含10%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，并调整细胞密度至1×105个/ml，接种细胞到6孔细胞培养板，每孔添加2 ml细胞悬液，37 ℃和5%CO2条件下培养24 h，然后进行转染实验，转染过程及RNA用量完全参照试剂盒Lipofectmaine 2000说明书。实验分为4组，A549细胞对照组、miRNA-30a NC转染组、miRNA-30a-5p inhibitor转染组和miRNA-30a-5p inhibitor且pshRNA-SCARA5转染组。转染后48 h，收集细胞，提取细胞Total RNA，荧光定量法检测hsa-miRNA-30a-5p含量，同时，提取细胞总蛋白，用Western blotting法检测胞内SCARA5蛋白相对含量。

2.6 A549细胞增殖活性的检测

实验分为4组，A549细胞对照组、miRNA-30a-5p NC转染组、miRNA-30a-5p inhibitor转染组和miRNA-30a-5p inhibitor且pshRNA-SCARA5转染组。取转染后48 h的A549细胞，胰酶消化法制备细胞悬液，离心收集细胞沉淀，用含10%FBS的RPMI1640完全培养基调整细胞密度至1×105个/ml，接种细胞到96孔细胞培养板，每孔添加100 μl细胞悬液，轻晃培养板使其分布均匀，37℃和5 % CO2条件下培养细胞，并于接种后的24、48、72 h，采用MTT法检测细胞活性。检测前，每孔细胞加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，轻晃使其分布均匀，继续培养4 h，去上清液，每孔加入150 μl DMSO溶液，37℃孵育15 min，酶标仪检测570 nm波长(A570)细胞液的吸光度值，根据吸光度值制作细胞对数期生长曲线。

2.7 real time-PCR检测hsa-miRNA-30a-5p含量

取2 μg 的Total RNA，反转录制备cDNA，反转录过程使用特异反转录引物，H.sapiens 6 snRNA:5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′；hsa-miRNA-30a-5p，5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG GAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTTCC-3′，取2 μl反转录产物作为PCR模板，荧光定量法检测hsa-miRNA-30a-5p含量。2ΔΔCt法分析定量结果，内参选用U6(NM_001101.3)。PCR引物序列：U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGC AGCACAT-3′，下游引物5′-TACCTTGCGAAGTGC TTAAAC-3′； hsa-miRNA-30a-5p上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCT CTGGCTC-3′，下游引物5′- TGTAAACATCCTCGACTGGAAG -3′。PCR使用20 μl体系，其中，SYBR Premix Ex Taq 10 μl，引物(20 μmol/L)各取0.2 μl，模板使用量为2 μl，反应体系用dH2O补足。PCR条件：95℃变性10 s；58℃退火10 s；72 ℃延伸10 s，循环数设置为40。结果分析中，以U6作为对照，通过Ct值进行数据分析。Ct值通过交点法计算获得，即通过扩增曲线与阈值线的交点来计算Ct值。相对定量的结果则通过ΔΔCt法进行解析，目的基因相对于内参基因的表达量为2ΔCt=2Ctm-Ctn。

2.8 Western blotting检测SCARA5蛋白含量

将浓度测定后的总蛋白以每组10μl进行垂直电泳，SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度为10%，经110 V电压90 min电泳后，立春红染色观察蛋白条带是否完整，400 mA电流转膜90 min，转膜后以5%的脱脂牛奶封闭2 h，4 ℃一抗过夜孵育，SCARA5和GAPDH一抗(TBST)稀释比分别为1∶300和1∶1 000；TBST洗膜3次，加入二抗孵育2 h，羊抗鼠二抗稀释比为1∶2 000；TBST洗膜3次，添加化学发光液反应底物，暗室曝光，扫描曝光底片，统计目的条带光密度值(D值)。D值目的蛋白/D值GAPDH，即为SCARA5蛋白的相对含量。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 肿瘤标本中hsa-miRNA-30a-5p与SCARA5蛋白含量检测

Hsa-miRNA-30a-5p相对含量检测数据(图1A)显示，与癌旁组织比较，肺癌组织中的hsa-miRNA-30a-5p含量明显降低，组间差异显著(P<0.05)，数据以(均值±标准差)表示，实验设置3次独立的生物学重复; SCARA5蛋白含量检测结果(图2B)显示，肺癌组织和癌旁组织中蛋白含量分别为(1.00±0.38)和(4.29±1.18)，统计结果显示，组间差异显著(P<0.05)。

图1 肿瘤标本中hsa-miRNA-30a-5p与SCARA5蛋白含量检测 A.肺癌及癌旁组织中hsa-miRNA-30a-5p相对含量检测结果，U6为内参；B.肺癌及癌旁组织中SCARA5蛋白表达检测结果，GAPDH为参照蛋白；**P<0.01，与肿瘤组比较

3.2 Hsa-miRNA-30a-5p与SCARA5靶位关系验证

生物信息学预测显示，hsa-miRNA-30a-5p在SCARA5基因3′UTR区有8个碱基的结合位点(图2A)。分别将miRNA-30a-5p mimics、miRNA-30a-5p inhibitor、miRNA-30a-5p NC与两组荧光素酶报告基因表达载体pGL3-WT- SCARA5和 pGL3-MT- SCARA5进行共转染，转染后48 h，荧光素酶相对活性检测结果显示(图2B)，miRNA-30a-5p mimics能够明显抑制野生型荧光素酶表达载体荧光素酶活性，从(3.98±0.61)降至(1.62±0.31)，差异具有统计学意义(P<0.05)，而miRNA-30a-5p inhibitor则能够增强野生型荧光素酶报告基因表达载体的荧光素酶活性，(3.98±0.61)上升至(6.27±0.35)，组间差异显著(P<0.05)；对于突变型荧光素酶报告基因表达载体，无论miRNA-30a-5p mimics或者miRNA-30a-5p inhibitor都对其无明显影响。以上数据和结果说明，hsa-miRNA-30a-5p与SCARA5基因之间的预测靶位确实存在。

图2 荧光素酶活性检测 A.hsa-miRNA-124-3p与SCARA5基因3′UTR结合位点的生物信息分析；B.A549细胞转染后24 h，细胞内荧光素酶活性检测结果注：“+”代表转染，“-”代表不转染*P<0.05，**P<0.01，与pGL3-WT-SCARA5转染组比较

3.3 转染后A549细胞内hsa-miRNA-30a-5p及SCARA5蛋白含量检测

A549细胞转染miRNA-30a inhibitor后48 h，细胞内hsa-miRNA-30a-5p含量明显降低(图3A)，与对照组比较，差异显著(P<0.05)，而miRNA-30a-5pNC转染组hsa-miRNA-30a-5p含量与对照组比较，无明显差异(P>0.05)；蛋白含量检测结果说明(图3B)， 转染miRNA-30a-5p inhibitor后48 h，细胞内SCARA5含量明显上升，与细胞对照组比较，差异显著(P<0.05)，而miRNA-30a-5p inhibitor与沉默载体pshRNA-SCARA5共转染组细胞内SCARA5蛋白表达与对照组比较，无明显差异(P>0.05)。

3.4 hsa-miRNA-30a-5p含量变化对A549细胞增殖活性的影响

细胞瞬时转染后24～72 h，各组细胞增殖活性检测结果(图4)显示，转染后48、72 h，与转染对照组比较，miRNA-30a-5p inhibitor转染组A549细胞增值活性明显降低(P<0.05)，pshRNA- SCARA5与miRNA-30a-5p inhibitor转染组细胞增殖活性则明显增强(P<0.01)，恢复到基因干预前的水平。

图3 转染后A549细胞内hsa-miRNA-30a-5p及SCARA5蛋白含量检测 A.A549细胞转染后48 h，各组细胞内 hsa-miRNA-30a-5p含量检测结果；B.A549细胞转染后48 h，各组细胞内SCARA5蛋白含量检测结果*P<0.05,与细胞对照组比较

图4 A549细胞增殖活性检测 **P<0.01,与细胞对照组(相同时间点)比较

4 讨论

微小RNA(miRNA) 属于内源性非编码RNA，广泛分布于基因组，其成熟体长度一般为20～25个碱基。从遗传进化学角度来讲，miRNA具有高度保守性。miRNA具有多种生物功能，这些功能主要通过对其靶基因的调控来实现，miRNA通过种子区可以与其靶基因3′-UTR区结合，从而抑制基因翻译[4]。miRNA与肿瘤关系密切，可调节细胞凋亡、生长、增殖、迁移、侵袭，通过参与多种信号通路的靶蛋白的克隆形成和血管生成，参与关键的发病机制[5-6]。Winther等研究表明，miRNA-21可作为食管腺癌及食管鳞癌的独立预后因素[7]。Wang等通过研究发现，miRNA-128b在胃癌的发病进程中起重要作用，过表达miRNA-128b可抑制胃癌细胞的增殖，同时诱导胃癌细胞产生凋亡[8]。miRNA-10a，miRNA-26，miRNA-126a，miRNA-210，miRNA-342和miRNA-519a被证实可以作为乳腺癌的生物学标志物，且与乳腺癌对一线用药他莫昔芬的药物敏感性有关[9]。miRNA-29b及miRNA17则被证实在肠癌的调控机制失活中扮演了关键角色[10-11]。这些研究表明，miRNA是多种肿瘤发病机制的内在原因，而其也可以成为肿瘤基因治疗的切入点。过去的4年中，肺癌的总体5年生存率仅上升了4%，早期较低的诊断率是改善肺癌预后的主要障碍，肺癌切除术患者生存率大于80%，这也表明肺癌的早期检测和诊断对提高患者的生存率至关重要，而血清中miRNA作为非侵入性肺癌生物标志物被陆续发现和证实[12]。Chen等研究证实，miRNA-25可以通过其靶基因RGS3调控非小细胞肺癌细胞株A549和H520的增殖和侵袭[13]。另外，还有miRNA-143-3p,miRNA-218,miRNA130家族[14-16]和miRNA-630[17]均与肺癌的生物学调控机制有关。所有这些研究表明，miRNAs在肺癌的发病机制中很可能形成一个网络调控系统，对相关的miRNA进行研究，将有助于寻找新的miRNA靶基因和新的肺癌基因治疗靶点[18]。

SCARA5于2009年被我国科学家发现，一系列的研究表明，SCARA5基因作为肝癌抑制基因，在肝癌组织中表达下降，SCARA5的肝癌抑制作用可能是通过抑制FAK蛋白的激活来实现的[3]。Khamas 等通过研究证实，SCARA5在肠癌中表达异常[19]。在胶质瘤细胞U251中过表达SCARA5，可以显著抑制肿瘤细胞的增殖，显著降低克隆形成、迁移和体外侵袭，体内实验也表明，SCARA5过表达可以抑制皮下肿瘤的增殖[20]。Liu等通过实验证实，SCARA5与A549细胞的EMT有关,并认为是转录因子SNAIL1的负调控作用所致[21]。Hsa-miRNA-30a-5p及其家族是高度保守的miRNA家族，与肿瘤发生、发展密切相关，hsa-miRNA-30a-5p下游目标包括转录因子如ITGB3、DTL、EWS-FLI和CD99等，通过调节这些下游目标蛋白的表达，参与调节结直肠癌、尤文瘤等类型肿瘤的发生与发展[22-24]。Hsa-miRNA-30a-5p与肺癌的相关研究较少，与SCARA5的相关研究则目前未见报道。我们在肺癌组织中验证SCARA5的表达，数据显示SCARA5在肺癌组织中的表达量明显低于癌旁组织，hsa-miRNA-30a-5p在肺癌与癌旁组织中的表达与SCARA5呈显著负相关。

我们的研究显示，hsa-miRNA-30a-5p与SCARA5具有显著负相关性，hsa-miRNA-30a-5p在肺癌中的高表达导致了肿瘤组织内SCARA5表达的显著降低。MTT检测结果显示，通过miRNA-30a-5p inhibitor转染可以明显抑制A549细胞对数生长期增殖活性，当miRNA-30a-5p inhibitor与SCARA5基因沉默同时进行时，A549细胞增殖活性又恢复到基因干预前的水平。这些数据说明，miRNA-30a-5p inhibitor确实是通过抑制A549细胞内hsa-miRNA-30a-5p的表达，增强了其靶蛋白SCARA5含量，而高表达的SCARA5则明显抑制了A549细胞的增殖活性，因此在肺癌细胞A549中，SCARA5显然作为抑癌蛋白发挥作用。

本研究的意义在于证实hsa-miRNA-30a-5p是肺癌细胞中SCARA5蛋白低表达的主要因素，通过抑制肿瘤细胞内hsa-miRNA-30a-5p，可以显著上调其靶蛋白SCARA5的表达，进而显著抑制肿瘤细胞A549的增殖活性。该实验结果提示我们，hsa-miRNA-30a-5p可成为潜在的肺癌基因治疗靶点。