龙脑樟Actin基因的克隆与序列分析

张君诚，许晓颖邹函卓，杨 琳

(1.天然药物开发利用福建省高校工程研究中心，福建 三明365004 2.福建农林大学 林学院，福建 福州350001)

龙脑樟(Cirmamonun camphora)是樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)亚热带阔叶林植物，富含右旋龙脑，龙脑又称为天然冰片，是药材和高级香料[1]，在化工、医药等领域中发挥重要作用，目前主要分布于江西吉安、湖南新晃等部分地区[2]。 近年来，以龙脑樟萜类有效成分合成相关的关键基因逐渐被挖掘，对挖掘的这些基因进行荧光定量分析，有助于阐明这些基因的功能，以及与萜类成分积累的关系。

Actin 又称为肌动蛋白，是一种重要的细胞骨架蛋白。它在细胞的运动定位、细胞分裂、胞吞和胞吐作用、细胞内囊泡运输、细胞的信号转导、共生现象、细胞器的运动以及膜的循环利用中发挥着重要的作用[3-9]。 研究表明，Actin 基因基因编码一类高度保守的蛋白，在植物的各器官、细胞和组织中的表达量相对比较恒定[10-12]，因此也经常作为荧光定量分析的内参基因参。Yan 和Shi 首次从高等植物中克隆得到 Actin 基因后[13]，研究人员从火龙果[14]、木薯[15]、芍药[16]、茶树[17]、蕙兰[18]、玉兰[19]、水稻等植物中克隆出该基因。然而龙脑樟Actin 基因的研究尚未见报道。本研究设计特异性引物，利用同源克隆的方法克隆出龙脑樟Actin 基因片段， 为Actin 基因作为内参基因进行龙脑樟相关功能基因的表达差异研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

来自江西吉安移栽至三明种植一至二年生的龙脑樟叶片。

1.2 仪器和试剂

梯度 PCR 扩增仪（Eppendorf 5331 型）、试验所用 OmniPlant RNA Kit 试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、2×Es Taq MasterMix （含 Es Taq DNA Polymetase、2×Es Taq PCR Buffer、3 mM MgCl、400 μM dNTP mix、染料）、快速琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒，上述试剂盒均来源于北京康为世纪生物科技有限公司，其余试剂采用国产分析纯。

1.3 龙脑樟叶片总RNA提取及cDNA的合成

龙脑樟叶片总RNA 的提取方法采用北京康为世纪生物科技有限公司OmniPlant RNA Kit 试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作，提取的总RNA 用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。用cDNA 合成试剂盒（HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒）对龙脑樟叶片总RNA 进行cDNA 的合成。 按照试剂盒说明书进行操作，合成的cDNA 用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 龙脑樟Actin基因克隆

根据NCBI 上已发表的香樟Actin(ACTc)基因（GenBank：KM086738.1）核苷酸序列的特异区域，利用 Primer5.0 软件设计 PCR 特异引物， 序列分别为 5'-TGTTCTGGACTCGGGTGA-3' / 5'-ATGGATTCCTGCTGCTTC-3'。 PCR 反应程序为：预变性 94 ℃，5 min；变性 94 ℃，30 s，退火 52 ℃，30 s，延伸 72 ℃，1 min，共 30 个循环；终延伸 72 ℃，10 min。 1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。

1.5 序列分析

在NCBI 中通过BLAST/P 对已得到的龙脑樟核苷酸序列片段以及推导的氨基酸序列的理化性质、三级结构等进行预测。并与GenBank 中下载香樟、山鸡椒、白玉兰、鳄梨等植物的Actin 基因的氨基酸序列进行多序列比对，利用MEGA6.0 软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 龙脑樟Actin基因扩增

RNA 电泳结果（见图1A）表明，28S 和 18S 条带清晰，且 28S 的 RNA 条带亮度约为18S 的 RNA条带亮度的2 倍，说明提取的RNA 完整性良好，可用于后续逆转录。转录成cDNA 结果显示，合成的cDNA 在1000 至100 bp 之间呈弥散状分布，说明反转录的效果较好，可以用于后续龙脑樟Actin 基因的克隆试验（见图1B）。根据同源扩增设计的特异引物，以总RNA 逆转录的cDNA 为模板，PCR 扩增产物凝胶电泳分离出特异片段，片段大小在250 与500 bp 之间（图片1C）。

图1 龙脑樟Actin 基因片段的扩增

2.2 龙脑樟Actin基因序列

对特异片段的序列分析结果， 获得龙脑樟333 bp 的Actin 基因序列。 利用DNAMAN 对龙脑樟Actin 基因片段的核苷酸序列进行氨基酸序列推导， 该序列编码110 个氨基酸 （如图2A）。 龙脑樟Actin 基因推导蛋白的分子量12.37 kDa，等电点Ph 5.03，总平均疏水性指数（Grand average hydropathicity， GRAVY）-0.312 （小于 0）。 二级结构中 α 螺旋、β 片层和无规则卷曲的比例分别为 40.04%、10.09%和45.87%。 龙脑樟Actin 基因推导的氨基酸序列预测的三级结构如图2B 所示。

图2 龙脑樟Actin 基因推导的氨基酸序列及预测的三级结构

2.3 龙脑樟Actin蛋白多序列比对

利用DNAMAN 将本研究的龙脑樟Actin 基因片段及推定蛋白与特定序列进行多序列比对。 龙脑樟Actin 基因推定的氨基酸序列与拟南芥、香樟、山鸡椒、白玉兰、玉米、水稻、鳄梨、胡杨的相似性均在 85%以上， 其中与山鸡椒 （GenBank 登录号 KF706373.1) 和香樟 Actin 基因 （GenBank 登录号KM086738.1）相似度都高达 93%（图3）。

图3 龙脑樟Actin 蛋白的多序列比对

2.4 龙脑樟Actin蛋白发生关系树分析

11 种植物Actin 蛋白的进化树分析表明， 龙脑樟与香樟、山鸡椒的Actin 蛋白具有较高的同源性（图4）。

图4 11 种植物推导Actin 蛋白的进化树

3 讨论

Actin 基因是一种起源比较早的基因，研究表明，Actin 基因的核苷酸序列在高等植物中是相当保守的， 并且在哺乳动物和植物之间大约有90%的相似性[20]。Actin 基因家族是植物表达研究中使用次数最多的管家基因。 本研究通过同源克隆的方法，得到龙脑樟333 bp 长度的Actin 基因片段。该片段编码110 个氨基酸， 蛋白分子量为12.37 ku， 理论等电点为5.03，平均疏水性（GRAVY）为-0.312，α 螺旋、β 片层和无规则卷曲的比例分别为40.04 %、10.09%和45.87%。同源比对和进化树分析结果都表明，龙脑樟与香樟、山鸡椒的亲缘关系最近，聚为一支；与木兰科的白玉兰、樟科的鳄梨、杨柳科的胡杨的亲缘关系次之。该基因的进化关系符合真实物种间的进化顺序。 龙脑樟Actin 基因序列的克隆，不仅为研究龙脑樟及其近源物种的系统发生提供参考，也为后续的量化基因表达研究奠定基础。