精氨酸脱亚胺酶对黄酒酿造中氨基甲酸乙酯形成的影响

李加友，陈涛

(1.嘉兴学院 生物与化学工程学院，浙江 嘉兴 314001；2.宿迁市产品质量监督检验所，江苏 宿迁 223800)

氨基甲酸乙酯(EC)被世界卫生组织认定为2 A级致癌物，联合国粮食及农业组织建议成年人每天的EC总摄入量不超过15 ng·kg-1(以体重计)。黄酒中的EC是发酵过程中酵母及其他微生物代谢产生的。尿素、精氨酸、氰化物等都可以代谢形成EC的前体物质，如氨甲酰磷酸、瓜氨酸等[1-2]。精氨酸是黄酒中EC形成的主要原因之一。精氨酸可以经脱亚胺途径产生瓜氨酸和氨甲酰磷酸，从而导致氨基甲酸乙酯的形成[3]；因此，研究黄酒生产过程中精氨酸脱亚胺酶的变化情况，掌握形成EC的前体物变化规律，对建立控制黄酒产品中氨基甲酸乙酯含量的新工艺具有重要参考价值。为此，特开展试验研究，并总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

糯米，市售；麦曲，购自江苏微康生物科技有限公司；酒曲和黄酒酵母，购自湖北安琪酵母股份有限公司；柠檬酸(分析纯)、L-精氨酸(分析纯)、L-瓜氨酸(分析纯)，均购自上海生工股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黄酒酿造

取500 g糯米浸泡48 h，蒸饭前沥干，蒸汽穿透25 min。用摊饭法冷却米饭温度至28 ℃，将其加入发酵缸中，然后加入25 g麦曲、5 g黄酒酵母(加入前按照使用说明进行活化)、1 L温开水(40 ℃)，搅拌，使发酵剂和米饭均匀分布。将发酵缸置于25 ℃培养箱，5 d后将培养温度调整为18 ℃，并用柠檬酸调节体系的pH至3.5。发酵过程中每隔2 d定期取样检测醪液中的精氨酸和瓜氨酸含量。以上工艺均按照无菌操作要求，严格控制环境中杂菌进入发酵体系，保持发酵体系的生物稳定性。

1.2.2 精氨酸脱亚胺酶粗酶液制备

取酒样上清液5 mL，在低温下进行超声细胞破碎(功率400 W、破碎时间15 min、间歇时间15 min)，10 000 r·min-1离心15 min，弃沉淀，将上清液定容到5 mL即得待测粗酶液。

1.2.3 精氨酸脱亚胺酶酶活测定

取500 μL 100 g·L-1的L-精氨酸溶液和400 μL 20 mmol·L-1pH 5.5的磷酸盐缓冲液于试管中，加入100 μL粗酶液，充分混匀，45 ℃水浴下反应10 min，迅速煮沸10 min终止反应，10 000 r·min-1离心10 min，测定上清液瓜氨酸含量。

酶活定义：以1 min产生1 μmol的L-瓜氨酸所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

1.2.4 精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸含量测定

酒样醪液经10 000 r·min-1离心10 min后，准确移取0.5 mL上清液、0.5 mL 0.5 mol·L-1的NaHCO3溶液0.2 mL和25 mL·L-12,4二硝基氟苯(DNFB)衍生化试剂于10 mL试管中，混合后置于60 ℃水浴中避光恒温加热60 min，避光冷却至室温后用pH值7.0的磷酸盐缓冲溶液定容至5 mL，静置15 min，过0.22 μm膜后进样分析。

采用戴安U-3000高效液相色谱仪进行检测，其中色谱柱为Acclaim120，C18，5 μm Analytical(4.6 mm×250 mm)，紫外检测波长360 nm，进样量20 μL，柱温30 ℃，流动相B为超纯水，流动相C为乙腈溶液，流动相D为乙酸钠，流速0.8 mL·min-1，时间26 min。梯度洗脱程序如下：0 min，流动相B、C、D的体积分数分别为15%、15%、70%；13 min，流动相B、C、D的体积分数分别为31%、31%、38%；21 min，流动相B、C、D的体积分数分别为34%、34%、32%；23 min，流动相B、C、D的体积分数分别为50%、50%、0；26 min，流动相B、C、D的体积分数分别为15%、15%、70%。

2 结果与分析

2.1 黄酒酿造过程中精氨酸脱亚胺酶的形成动力学

如表1所示，黄酒酿造过程中精氨酸脱亚胺酶的活性随着时间推进而有所不同：直到酿造的第4天，才检测到精氨酸脱亚胺酶活性，此后其活性逐步增加，第10天时其活性达到72 U·mL-1，之后一直到第24天酶活变化不大，基本维持在72～76 U·mL-1，随后精氨酸脱亚胺酶活性再次逐步增加，第44天时达到146 U·mL-1，此后又维持在相对稳定的范围内。

黄酒酿造过程中的精氨酸脱亚胺酶的活性变化可以分为2个阶段：4～12 d为第1阶段，24～44 d为第2阶段。分别对这2个阶段的精氨酸脱亚胺酶活性做动力学分析，得到2个拟合模型(y为酶活，x为时间)：

第1阶段的拟合模型为y=1.5x4-20.667x3+98.5x2-177.33x+144(R2=1.000)；

第2阶段的拟合模型为y=-0.049 8x4+1.265 9x3-9.898 9x2+30.604x+51.758(R2=0.994 6)。

R2均大于0.99，说明回归拟合效果好。

表1 黄酒酿造过程中精氨酸、瓜氨酸含量和精氨酸脱亚胺酶活性的变化

注：-表示没有检到。

对醪液中精氨酸脱亚胺酶催化产物瓜氨酸的检测结果发现，在酿造的前14 d均未能检测到瓜氨酸，此后瓜氨酸的含量逐步增加，到24 d后瓜氨酸的含量相对稳定，自38 d开始稍有下降，但相对稳定。醪液中的精氨酸含量从酿造开始就逐步增加，至34 d时达到较高水平，此后精氨酸的含量保持相对稳定。

通过对黄酒酿造过程中精氨酸脱亚胺酶活性及其酶解产物含量的定量分析，发现了精氨酸脱亚胺酶的阶段性变化特征，并且酶活呈上升趋势；但是，在精氨酸含量逐步增加的情况下，瓜氨酸的含量在24 d后却没有明显增加。这可能是因为瓜氨酸持续转化成了鸟氨酸。精氨酸脱亚胺酶和鸟氨酸氨甲酰转移酶是同簇基因，它们的转录是同步进行的。

2.2 醪液中精氨酸脱亚胺酶的催化特性

2.2.1 温度对精氨酸脱亚胺酶活性的影响

温度是影响酶催化的重要因子，考查精氨酸脱亚胺酶在不同温度条件下的酶活，确定其受温度影响的程度。结果(图1)表明，随着反应温度提高，精氨酸脱亚胺酶催化产瓜氨酸的酶活先显著增高后下降，在60 ℃时酶活最高。

图1 温度对精氨酸脱亚胺酶活性的影响

2.2.2 pH值对精氨酸脱亚胺酶活性的影响

比较不同pH值的缓冲体系对精氨酸脱亚胺酶催化活性的影响，结果如图2所示。当pH值为6～7时，酶活较大。黄酒酿造中醪液的pH值通常在3～4，精氨酸脱亚胺酶在pH值为4时的酶活是pH值为3时的2倍，由此可知，精氨酸脱亚胺酶活性受醪液pH值影响显著，控制醪液pH值会对醪液中精氨酸的代谢产生重要影响。

图2 pH值对精氨酸脱亚胺酶活性的影响

2.3 精氨酸代谢对黄酒中氨基甲酸乙酯形成的影响

根据对黄酒中精氨酸脱亚胺酶的初步研究结果，比较不同酿造条件下产品中的EC含量，确定精氨酸代谢对EC形成的影响。结果(表2)表明，当起始pH值为3时，醪液中的精氨酸脱亚胺酶活性受到明显抑制，分别为对照组(pH值为3.5)和起始pH值为4时的23%和22%，且产品中的EC含量也只有对照组和起始pH值为4时的35%和32%，说明控制酿造过程的pH值对精氨酸脱亚胺酶活性和EC形成均有显著作用。

表2 起始pH值对氨基甲酸乙酯形成的影响

3 小结与讨论

氨基甲酸乙酯的大部分前体物质来源于发酵过程的微生物代谢，通过代谢过程控制或者菌种选育减少前体物质的形成，可以减少产品中的氨基甲酸乙酯[4]。利用精氨酸代谢酶抑制剂控制瓜氨酸等前体物质的形成[5]；精氨酸酶缺陷型或表达受阻的酵母突变菌株不能转化精氨酸形成尿素[6-8]；将脲基酰胺酶基因整合到酵母菌中，提高脲基酰胺酶的表达能力，可以降低尿素含量[9]；精氨酸转化能力受阻的酒类酒球菌不能转化精氨酸为瓜氨酸和氨甲酰磷酸[10]，利用以上方法或菌株生产的葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量显著下降。酒中氨基甲酸乙酯的形成机理不同，控制方法各异。

通过对黄酒酿造过程中精氨酸脱亚胺酶活性动力学及其底物、产物的过程分析，初步掌握了黄酒中精氨酸的代谢过程。根据精氨酸脱亚胺酶的酶学性质，建立了一个控制精氨酸酶解产瓜氨酸和氨甲酰磷酸的工艺措施，降低了醪液中氨基甲酸乙酯前体物浓度，产品中氨基甲酸乙酯含量得到有效控制。结果表明，降低黄酒起始pH值对于控制产品中氨基甲酸乙酯的形成是一个切实可行的工艺措施。