五福饮含药血清对大鼠软骨细胞肿瘤坏死因子-α 诱导凋亡软骨细胞活性及基质金属蛋白酶表达的影响

汪灿锋 叶正从 沈钦荣 韩 雷 曹国平

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是指由多种因素引起关节软骨纤维化、脱落而导致的以关节疼痛为主要症状的一种退行性关节疾病，属中医“痹证”范畴，治疗主要以活血通络、温经散寒、滋补肝肾等法为主。五福饮为明代医家张景岳治疗五脏气血不足的代表方，通过前期临床研究证实，其治疗膝OA 疗效确切，但具体作用机制尚不明确[1]。本实验采用五福饮含药血清培养退变关节软骨细胞，研究五福饮对大鼠退变关节软骨细胞活性及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的影响，探讨其防治关节软骨退变的可能作用机制。现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级雌性Wistar 大鼠30 只，体质量150～180g。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016。饲养条件：所有大鼠均饲养在屏障环境内，每笼饲养6只，温度（22±2）°C，湿度50%～60%，光照每12h 明暗交替，换风次数15～20 次/h。由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养。实验饲养室许可证号SYXK（浙）2013-0184。本实验经浙江中医药大学动物管理与伦理委员会审核通过。

1.2 主要仪器与试剂 细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific，型号BB150），流式细胞仪（美国Becton，Dickinson and Company，型号Accuri C6），酶标仪（美国SpectiaMax，型号CMaxPius），电泳仪（天能，型号EPS300），电泳槽（天能，型号VE 180C），转膜仪（天能，型号VE186），普通PCR 仪（德国Eppendorf，型号Mastercycler），核酸定量仪（美国Thermo Fisher Scientific，型号Nanodrop one），实时荧光定量PCR 仪（瑞士Roche，型号LightCycler）。

Anti-Rat TNF-α（美国PeproTech，货号500-P72，批号AD36532623），Collagen II（英国Abcam，货号ab34712，批号GR221316-10），DMEM 高糖培养基（ 美 国 Hyclone， 货 号 SH30243.01， 批 号AD24464275），胎牛血清（四季青，货号11011-8611，批号20171203），MTT 试剂盒（BBI LIFE SCIENCES，货号BS6334-500T，批号DB30FA0005），PBS 磷酸盐 缓 冲 液（pH7.2 -7.4）（美 国 Hyclone 货 号SH30256.01，批号AD22391274 ），二抗Alexa flour（594 美国Abcam，货号ab150076，批号GR235615-2），DAPI（SIGMA，货号D9542，批号NC45325V），RIPA 裂解液（Beyotime，货号P0013D，批号10352），蛋白酶抑制剂（康为世纪，货号60237，批号50321），BCA 蛋白定量试剂盒（Solarbio，货号pc0020，批号20180328），化学发光检测试剂（Solarbio，货号PE0010，批号20181220），10%APS（Biosharp，货号A600072-0025，批号DC20BA1005），PVDF 膜（瑞典GE Healthcare Life Sciences，货号10600023，批号A16954279），Anti-collagen Ⅱ（美国abcam，货号ab34712，批号GR198512-4），Anti-actin（华安，货号EM21002，批号HK0824），Trizol（Sangon Biotech，货号B548124-0500，批号E108KA7471），SYBR Green qPCR 试剂盒（康为世纪，货号CW2601，批号H7825250），逆转录试剂盒（康为世纪，货号cw2569m，批号30251）。

1.3 实验药品 硫酸氨基葡萄糖胶囊：本院药剂科提供，商品名为伊索佳，浙江海正药业股份有限公司生产，批号71805311，规格：0.314g/粒。五福饮制剂：根据《景岳全书》卷五十的方药制备：党参、熟地各30g，炒白术、当归各20g，炙甘草10g，药液浓缩至1mL 含生药4g，由本院中药制剂室提供。

2 实验方法

2.1 动物分组及血清制备 2 月龄大鼠采用随机数字表法分为生理盐水组（生理盐水灌胃）、硫酸氨基葡萄糖组（硫酸氨基葡萄糖灌胃）、五福饮组（五福饮灌胃），每组10 只。硫酸氨基葡萄糖成人的每天剂量依照说明书定为1.5g。按人-大鼠体表面积比值折算成相当于人临床剂量20 倍量，给予大鼠口饲剂量，每100g 大鼠灌胃2mL 计算给药浓度。隔天称重算出相应剂量给药物组灌胃，2 次/天，连续灌胃7 天。第7天，在灌胃2h 后予以眼球取血。经离心、灭活、过滤除菌后，4mL 每瓶分装，贴好各组别血清标签，-20℃保存备用。

2.2 软骨细胞提取及培养 取2 只2 月龄雌性大鼠，脱颈处死，酒精消毒后移入超净台，提前备好含有1%双抗的无菌PBS。在无菌条件下切取大鼠双侧髋、膝关节，经PBS 液漂洗后装入无菌离心管并迅速转移至细胞房生物柜。清理软骨周围的软组织，刀片削取关节软骨，再次经PBS 液清洗，剪碎至1mm3大小，装入培养皿，加入胶原酶Ⅱ（0.3U/mL），37℃下恒温消化4h。将消化后的细胞悬液经100μm 细胞筛网过滤，经1000r/min 离心5min，弃上清液，分别加入含10%FBS 的DMEM 培养液以1×105/mL 接种于培养瓶，置于5%CO2培养箱中进行传代培养用于后续实验。

2.3 软骨细胞干预 培养第2 代软骨细胞，分为以下四组进行药物处理。参考文献[2]采用20μg/L 肿瘤坏死因子-α 诱导软骨细胞凋亡。分为四组：空白组采用0μg/L TNF-α+10%生理盐水组血清；模型组采用20μg/L TNF-α+10%生理盐水组血清；对照组采用20μg/L TNF-α+10%硫酸氨基葡萄糖组血清；观察组采用20μg/L TNF-α+10%五福饮组血清，干预48h 后检测相关指标。

2.4 指标检测

2.4.1 Collagen II 表达检测 细胞生长至指数期时，消化后制备细胞混悬液并计数，准备铺板。具体方法如下：6 孔板每个孔中放入无菌高洁净度盖玻片，以60%～70%细胞密度即每孔5×105个细胞接种于盖玻片上，每孔体积2mL。加入1～2mL 预冷的4%多聚甲醛（PFA），固定10min 后PBS 漂洗3 次，每次5min；每孔加入1mL 0.1% Triton X-100，处理2min，2mL PBS 漂洗3 次，每次5min；每孔加入2mL 3%BSA 室温封闭30min；每个盖玻片上滴加80μL Collagen II 一抗（稀释比例1:50，稀释液5% goat serum 溶液），4℃过夜孵育；一抗孵育结束后，经漂洗后每个盖玻片上加入80μL 二抗（二抗稀释比例为1：500，用5% goat serum 稀释），室温避光下孵育30min。后续步骤需避光操作；每孔加入2mLPBS，漂洗3 次，每次5min；每孔加入核染试剂1μg/mL DAPI 染色2min。经PBS 漂洗后保持湿润，放入载玻片中在显微镜下观察拍照。检测各组细胞中Collagen II 的表达。

2.4.2 细胞增殖检测 细胞生长至指数期时，消化后培养基制备单个细胞混悬液并计数，以每孔1000个细胞接种到96 孔板，每孔体积200μL。细胞单层贴壁铺满孔底后，按照上述分组给药分别干预24、48、72h 后，每组3 个复孔。使用酶标仪检测各孔吸光度值（酶标仪在490nm）。

2.4.3 细胞凋亡检测 取对数生长期的软骨细胞种植于放有无菌高洁净度盖玻片6 孔板，每孔2mL 工作体积，细胞接种密度为1.2×106，按上述分组分别与药物共培养。各组干预后，弃培养液，取出盖玻片，4%多聚甲醛室温固定30min，PBS 清洗3 次，每次5min，1μg/mL DAPI 进行细胞核染色2min，染色结束后PBS 清洗并用指甲油封片。显微镜下观察、计软骨细胞的凋亡数量。

2.4.4 MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA 检测 用漩涡振荡器将管中溶液彻底混合均匀，短暂低速离心。反应条件：95℃，10min 变性；95℃，15s；60℃，60s；40 次循环。将以上步骤中混合好的液体加入孔板中，每个样本的每个基因保证3 个复孔。Real time PCR仪使用ABI7500 实时荧光定量PCR 仪，PCR 程序已优化。将以上已点好样的8 连管板置于Realtime PCR 仪上进行PCR 反应。反应条件：95℃，10min 变性；95℃，15s；60℃，60s；40 次循环。内参引物均由上海生工生物有限公司设计及合成，引物设计序列：MMP -3：5' -ATGCAGGGAAAGTGACCCAC -3'，5' -CGACGCCCTCCATGAAAAGA -3'；MMP -9：5' -GTGCCCTGGAACTCACACAAC-3'，5'-CCAGAAGTA -TTTGTCATGGCAGAA -3'；MMP -13：5' -TGCTGC -ATACGAGCATCCAT-3'，5'-TGTCCTCAAAGTGAACCGCA -3'；ACTB：5' -GGGAAATCGTGCGTGACA -TT-3'，5'-GCGGCAGTGGCCATCTC-3'。

2.5 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差表示，作图采用GraphPad Prism 6.2 软件。两组间比较采用两个独立样本的t 检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 含药血清对大鼠软骨细胞Collagen II 荧光表达的影响 与空白组比较，模型组、对照组和观察组大鼠软骨细胞Collagen II 平均荧光表达强度均降低（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，对照组和观察组大鼠软骨细胞Collagen II 荧光表达升高（P<0.05，P<0.01）。观察组大鼠软骨细胞Collagen II 荧光表达低于对照组（P<0.01），见表1，插页图1。

表1 各组大鼠软骨细胞Collagen II 免疫荧光表达量比较

表1 各组大鼠软骨细胞Collagen II 免疫荧光表达量比较

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与对照组比较，▲P<0.01；空白组：采用0μg/L TNF-α+10%生理盐水组血清；模型组：采用20μg/L TNF-α+10%生理盐水组血清；对照组：采用20μg/L TNF-α+10%硫酸氨基葡萄糖组血清；观察组：采用20μg/L TNF-α+10%五福饮组血清；Collagen II：胶原蛋白II

组别空白组模型组对照组观察组孔数3 3 3 3平均荧光强度值70.92±3.72 43.39±1.52**62.92±5.32*△△53.33±2.33**△▲

3.2 含药血清对大鼠软骨细胞增殖能力的影响 与空白组比较，24、48 和72h 给药时间点的模型组大鼠软骨细胞OD 值均显著降低（P<0.01），给药24h 后，对照组和观察组大鼠软骨细胞OD 值也显著低于空白组（P<0.01）；与模型组比较，对照组和观察组大鼠软骨细胞OD 值稍有升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。给药48h 后，对照组和观察组大鼠软骨细胞OD 值均低于空白组，高于模型组（P<0.05，P<0.01）。给药72h 后，对照组和观察组大鼠软骨细胞OD 值均低于空白组（P<0.05）；与模型组比较，对照组和观察组大鼠软骨细胞OD 值显著升高（P<0.01）；24、48和72h 时间点观察组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 给药24、48、72h 各组大鼠软骨细胞OD 值比较

表2 给药24、48、72h 各组大鼠软骨细胞OD 值比较

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；空白组：采用0μg/L TNF-α+10%生理盐水组血清；模型组：采用20μg/L TNF-α+10%生理盐水组血清；对照组：采用20μg/L TNF-α+10%硫酸氨基葡萄糖组血清；观察组：采用20μg/L TNF-α+10%五福饮组血清；OD 值：吸光度值

组别空白组模型组对照组观察组孔数3 3 3 3 24h 0.396±0.017 0.297±0.014**0.342±0.021**0.316±0.028**48h 0.470±0.018 0.333±0.021**0.414±0.029*△△0.394±0.028**△72h 0.570±0.031 0.361±0.014**0.510±0.035*△△0.493±0.030*△△

3.3 含药血清对大鼠软骨细胞凋亡的影响 经DAPI 荧光染色后，荧光显微镜下观察可得，空白组细胞核圆润完整，分布均匀荧光明亮，模型组细胞核出现碎裂，有较多不完整的细胞核，局部染色质出现的荧光高度集中。对照组和观察组的细胞核部分出现凝聚，有少量的核碎片。见插页图2。

3.4 含药血清对大鼠软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA 水平的影响 与空白组比较，模型组、观察组大鼠软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13及对照组MMP-9 mRNA 水平显著升高（P<0.01，P<0.05）。与模型组比较，对照组和观察组大鼠软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA 水平显著下降（P<0.01，P<0.05）。与对照组比较，观察组大鼠软骨细胞MMP-3 显著升高（P<0.05），MMP-9、MMP-13 表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA水平比较

表3 各组大鼠软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA水平比较

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与对照组比较，▲P＜0.05；空白组：采用0μg/L TNF-α+10%生理盐水组血清；模型组：采用20μg/L TNF-α+10%生理盐水组血清；对照组：采用20μg/L TNF-α+10%硫酸氨基葡萄糖组血清；观察组：采用20μg/L TNF-α+10%五福饮组血清；MMP：基质金属蛋白酶

组别空白组模型组对照组观察组孔数3 3 3 3 MMP-3 1.003±0.091 2.610±0.328**1.313±0.335△△1.994±0.134**△▲MMP-9 1.033±0.300 2.519±0.195**1.866±0.151*△2.000±0.053**△MMP-13 1.012±0.200 2.491±0.300**1.449±0.289△1.688±0.012**△

4 讨 论

软骨破坏是OA 的主要病理特征。关节软骨破坏包括软骨细胞自身降解软骨细胞外基质和炎症滑膜、血管翳组织、浸润的炎症细胞通过关节滑液（synovialfluid，SF）破坏软骨细胞外基质，两种途径中酶性降解细胞外基质是软骨破坏的主要原因[3]。研究表明，在各种蛋白酶中，MMPs 在关节软骨破坏中起重要作用，主要表现为：（1）通过阻断蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，使得关节软骨纤维结构遭到破坏；（2）MMPs特异性裂解胶原分子，胶原网损伤，炎性因子能直接攻击软骨细胞，最终导致关节炎[4]。MMPs 家族庞大，按其作用底物，主要分为胶原酶（MMP-1、MMP-8 和MMP-13）、基质溶解素（MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11）和明胶酶（MMP-2 和MMP-9）等亚家族，其中MMP-3、MMP-9、MMP-13 是关节软骨基质降解中最重要的酶[5-7]。目前一些OA 的治疗研究中[8-9]，通过下调MMPs 的表达，促进软骨细胞形成，起到治疗目的。通过调控MMPs 将可以延缓OA 进展，可作为OA 中重要的治疗靶点以作研究。

目前中医药治疗OA 仍是主要的保守治疗方式[10]，根据《中医骨伤科常见病诊疗指南》，目前OA 中药治疗主要以活血化瘀法，温经散寒、养血通脉法，滋补肝肾法为主。笔者通过前期临床治疗总结，结合明代医家张景岳《传忠录·治形论》中“中年修复”观点，认为中老年OA 的诊治，需要注重强形体，补五脏气血，遂用五福饮治疗膝OA。五福饮见于张景岳的《景岳全书》，该方药性平和，五味药归五脏，主治五脏气血亏损。笔者前期在临床取得满意疗效[1]，但其具体作用机制尚未完全清晰，本研究通过五福饮含药血清培养凋亡软骨，观察相关指标，探究五福饮治疗OA 相关作用机制。

本研究以TNF-α 诱导软骨细胞凋亡为OA 的细胞模型[2]，检测五福饮含药血清对模型下的Collagen II 荧光表达、软骨细胞软骨细胞增殖、凋亡及MMPs的影响。实验结果显示，经五福饮血清作用后观察组大鼠软骨细胞Collagen II 表达较空白组低，但较模型组高（P<0.05），与阳性药物对照组比较，Collagen II 表达降低（P<0.05）；在软骨细胞增殖和凋亡方面，与空白组比较，模型组细胞OD 值均显著降低（P<0.01）而与模型组比较，对照组和观察组细胞OD 值稍有升高，但差异无统计学意义；荧光染色后，显微镜下可观察到空白组的细胞核圆润完整，分布均匀荧光明亮，模型组细胞核出现碎裂，有较多不完整的细胞核，局部染色质出现的荧光高度集中，对照组和观察组的细胞核部分出现凝聚，有少量的核碎片。对照组和观察组MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA 水平较模型组显著下降（P<0.01 或P<0.05），MMP-9、MMP-13 mRNA 表达同对照组差异无统计学意义。

综上所述，通过降低软骨细胞MMPs 的表达来延缓OA 软骨细胞凋亡的进程，可能是五福饮治疗OA 的作用机制之一。[本文受到杭州市萧山区重大科技项目资助（No.2017213）]