激光诱导碳纳米笼对细菌的杀伤作用

韩春哲, 郭昱良, 陈 杨, 桂 馨

(同济大学生命科学与技术学院, 上海200092)

纳米材料用于杀菌是纳米生物学研究的热点, 其中石墨烯纳米片在抑菌方面的研究备受关注[1-5]. 石墨烯是当前最薄的二维纳米材料, 有巨大的比表面积. 与其他材料相比, 在质量相同的情况下, 石墨烯纳米片有更多的表面与细菌接触, 从而有可能更高效地杀伤细菌.

虽然石墨烯纳米片的两侧及其边界都能吸附药物, 但这些敞开的表面对其所载药物的缓释作用不佳. 若将石墨烯构筑而成的碳纳米笼(graphic carbon nanocages, GCNCs)作为抑菌材料, 则有可能保留石墨烯的优势, 又可以缓释药物, 达到多模式抑菌的效果.

GCNCs 是由石墨化碳壳层构筑而成的具有空心结构特点的纳米粒子. 富勒烯是目前粒径最小的GCNCs(直径仅约0.71 nm), 但其内部空腔几无载药功能. 通过含碳原子的前驱体(如金属碳基类化合物)以高温碳化方式获得的GCNCs, 不仅具有石墨壳层结构特点, 还有较大体积的内部空腔, 为后续载药提供了方便. 石墨壳层结构的GCNCs 因具有特殊的光电子特性,在电子屏蔽材料、太阳能吸收剂、催化剂、传感器、锂电池碳极等领域有较广泛的应用[6-11].目前, GCNCs 在生物医学领域的应用主要涉及对生物分子的吸附研究[12-13].

本课题组发现, GCNCs 是一种性能优异的光热转化材料, 这种热效应可用于杀菌.GCNCs 自身的毒性很小, 只有在激光照射下才会对细菌进行热杀伤, 因此其对环境产生污染的影响较小. 本工作结果将推动GCNCs 在生物医学领域, 尤其是在杀菌领域的研究.

1 材料与方法

1.1 实验材料

大肠杆菌(E.coli)菌种干粉购自中国工业微生物菌种保藏中心. 蛋白胨、酵母提取粉购自Oxide 公司. 琼脂购自上海沃凯化学试剂有限公司. 碳基铁、无水乙醇等其他试剂均购自国药集团上海化学试剂有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 GCNCs 合成及形貌表征

参考文献[14]合成GCNCs. 称取0.15 g 羰基铁溶于3 mL 无水乙醇, 置于真空管式炉中.在氮气保护下, 以5◦C/min 的升温速率升高到800◦C, 并在该温度下反应30 min. 在氮气保护下自然冷却. 收集粉末, 将样品置于50 mL 圆底烧瓶中, 加10%的盐酸30 mL, 70◦C 回流24 h. 高速离心, 弃上清, 沉淀加蒸馏水洗涤3 次后进行冷冻干燥, 得到GCNCs. 通过透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)观察GCNCs 的形貌.

1.2.2 671 nm 激光诱导GCNCs 的光热转换检测

用去离子水分散GCNCs 粉末, 获得浓度为0.05 和0.10 mg/mL 的两种溶液. 每个样品各取200 µL, 置于透明小玻璃管中, 开口处以封口膜封闭. 以低功率密度(0.2 W/cm2)的671 nm 激光照射样品, 使用红外热像仪检测样品升温速率. 以200 µL 去离子水在激光照射下的升温速率作为对照. 每个样品在每个照射时间节点进行3 次相同的照射实验.

1.2.3 LB 培养基的配置

称取NaCl 10 g、蛋白胨10 g、酵母提取粉5 g, 溶解于1 000 mL 蒸馏水中, 并在高压灭菌锅中121◦C 加压灭菌20 min, 之后于4◦C 保存备用. 如需固体培养基, 则在上述配方中加20 g 琼脂粉, 灭菌后趁热倒入平板, 冷却凝固后于4◦C 保存备用.

1.2.4 大肠杆菌培养及活性菌液的制备

在37◦C 预热的35 mL 液体LB 培养基中加入少量大肠杆菌干粉粉末, 置于50 mL 离心管内, 于37◦C, 220 r/min 摇床上培养过夜. 待菌液的OD600值约为0.5 时, 取0.1 mL 菌液重新加入35 mL 液体LB 培养基中, 同条件培养过夜. 之后用液体培养基将菌液的OD600值调整至0.5 后备用, 此时大肠杆菌的菌体浓度为5×108/mL.

1.2.5 GCNCs 对大肠杆菌生长过程中的毒性影响

取0.1 mL 上述菌液加入15 mL 培养基中, 并加入高压灭菌后的GCNCs, 使其终浓度为1 mg/mL. 在前述条件下进行培养, 并设置未加GCNCs 的菌液作为对照. 2 h 后, 每隔1 h 取0.1 mL 菌液检测OD600值, 用于绘制生长曲线, 直至吸收值不再明显增加. 实验平行进行3 次.

1.2.6 激光诱导GCNCs 对大肠杆菌的杀伤作用实验

取0.1 mL 上述菌液于2 mL 透光离心管中, 分别加入GCNCs 形成浓度梯度, 并分别用670 nm 近红外激光在管壁处照射20 min. 取不加GCNCs 的菌液进行同样的激光照射作为对照. 照射完毕后使用梯度稀释(103, 104及105倍)涂板法对菌液内的活菌数目进行记数, 并以无GCNCs 菌液的活菌数目作为标准计算活菌抑制率. 每个实验重复3 次.

取0.1 mL 上述菌液于2 mL 透光离心管中, 加入GCNCs 使其终浓度为Cmin, 并分别用670 nm 近红外激光在管壁处照射不同时间,形成时间梯度.照射完毕后,使用梯度稀释(103,104及105倍)涂板法对菌液内的活菌数目进行记数, 并以未进行激光照射的菌液的活菌数目作为标准计算活菌抑制率. 每个实验重复3 次.

1.2.7 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 22 提供的单因素ANOVA 分析样本各组间差异性, 其中*p ＜0.05 为具有统计学差异, **p ＜0.01 为具有显著的统计学差异, ***p ＜0.001 为具有极显著的统计学差异.

2 实验结果与讨论

2.1 GCNCs 在671 nm 激光照射下的光热转换

本工作以羰基铁为主要原料合成的GCNCs 样品如图1 所示. 这些粒子大部分为空心结构, 单个粒子直径主要分布在20～50 nm.

图1 GCNCs 的TEM 照片Fig.1 TEM image of GCNCs

红外热像仪检测结果显示, GCNCs 水溶液在671 nm 激光照射下, 升温迅速. 由图2 可见: 当GCNCs 浓度仅为0.05 mg/mL 时, 激光照射1 min 即可使200 µL 的溶液从最初的22.1±0.2◦C 上升到30.5±0.9◦C; 照射20 min 时, 溶液温度可达45.7±1.0◦C, 平均升温幅度超过22◦C. 随着GCNCs 浓度增加, 升温幅度更加显著. 当GCNCs 浓度提高到0.1 mg/mL,激光照射20 min 时, 溶液温度从最初的22.1±0.2◦C 上升到50.8±0.4◦C; 而相同体积的去离子水在激光照射20 min 后, 仅从最初的温度上升到27.7±0.5◦C. 可见, GCNCs 是一种性能优异的光热转化材料.

2.2 GCNCs 对大肠杆菌生长的影响

GCNCs 本身对细菌毒性小. 如图3 所示, 当向大肠杆菌中加入高压灭菌后的GCNCs 并使菌液中的GCNCs 浓度高达1 mg/mL 时, 无论是对数生长期(约6～8 h), 还是稳定生长期(约12 h 后), 大肠杆菌的生长速度都与未加GCNCs 的生长速度无明显差别, 生长曲线几乎重合.这表明GCNCs 可能是一种环境友好型的纳米材料.

图2 去离子水分散的GCNCs 及单纯的去离子水在671 nm 激光照射下的升温Fig.2 Temperature increase of distilled water containing GCNCs and distilled water alone upon 671 nm laser irradiation

图3 1 mg/mL GCNCs 对大肠杆菌生长的影响Fig.3 Effect of 1 mg/mL GCNCs on the growth of E. coli

2.3 671 nm 激光照射下GCNCs 对大肠杆菌的杀伤作用

GCNCs 在671 nm 激光照射下,能高效杀伤细菌. 如图4 所示: 当大肠杆菌中的GCNCs 浓度仅为1 µg/mL 时, 在671 nm 激光照射20 min 后, 细菌生长受到显著抑制; 随着GCNCs 浓度的升高, 抑制效果更显著, 当浓度达到75 µg/mL 时, 视野中仅存极少活菌; 当浓度达到100 µg/mL 或更高时, 细菌全部被杀灭; 而单纯的671 nm 激光照射对大肠杆菌的生长无明显影响. 可见, GCNCs 在671 nm 激光照射下产生的热效应是杀灭细菌的良好手段.

定量检测可进一步证实GCNCs 的光热效应能高效杀菌. 如图5 所示, 当GCNCs 浓度极低, 仅为5 µg/mL 时, 激光照射后细菌数量与对照组(不含GCNCs)相比减少了30%, 活菌数存在显著的统计学差异(p ＜0.01); 当浓度提高2 倍(即10 µg/mL)后, 活菌数与对照组相比有极显著的统计学差异(p ＜0.001); 当浓度为100 µg/mL 时, 活菌数为0.

图4 不同浓度GCNCs 经20 min 671 nm 激光照射后的抑菌效果(定性检测结果)Fig.4 Antibacterial effects of GCNCs on E. coli with different concentrations under 671 nm laser irradiation for 20 min (qualitative test results)

图5 不同浓度GCNCs 经20 min 671 nm 激光照射后的抑菌效率(定量检测结果)Fig.5 Antibacterial efficiency of GCNCs on E. coli with different concentrations under 671 nm laser irradiation for 20 min (quantitative test results)

在此基础上, 将大肠杆菌中的GCNCs 浓度稳定在100 µg/mL, 考察671 nm 激光照射时间对杀菌效果的影响, 结果如图6 和7 所示. 可见, 激光照射仅1 min 时, 活菌数就开始减少; 照射5 min 时, 82%的细菌被杀灭; 照射15 min 时, 计数平板上已无菌落, 表明细菌被全部杀灭.如果提高GCNCs 浓度, 则可以在更短的时间内杀灭细菌.

可见, GCNCs 在671 nm 激光照射下杀菌具有如下优点: GCNCs 生物相容性好, 使用浓度低, 杀菌时间短而高效.

图6 100 µg/mL 的GCNCs 经不同时间671 nm 激光照射后的抑菌效果(定性检测结果)Fig.6 Antibacterial effects of 100 µg/mL GCNCs on E. coli under 671 nm laser irradiation for different time period (qualitative test results)

图7 100 µg/mL 的GCNCs 经不同时间671 nm 激光照射后的抑菌效率(定量分析结果)Fig.7 Antibacterial efficiency of 100 µg/mL GCNCs on E. coli under 671 nm laser irradiation for different time period (quantitative test results)

3 结束语

以羰基铁为主要前驱体合成了GCNCs. 该GCNCs 在671 nm 激光照射下能迅速将激光能量转化为热能, 其光热效应对大肠杆菌有很好的杀伤效果, 且在很低浓度和激光照射时间很短的情况下即可完全杀灭细菌. 由于GCNCs 有容积可观的内部空腔, 这为今后装载抗生素或其他杀菌药物, 进而进行多模式杀菌提供了条件. 本工作合成的GCNCs 及其用于杀菌的方法为抗菌领域引入了新的材料, 对于推动GCNCs 的生物医学应用和改进杀菌策略有重要意义.

致谢感谢同济大学生命科学与技术学院的储茂泉教授提供研究思路和实验条件, 并参与有意义的讨论.