D-半乳糖/亚硝酸钠诱导痴呆小鼠大脑海马组织中CX43、MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表达

黄仕美 杨小蓉 罗亚 汪忠保 汪元河

(1贵州医科大学法医学院法医临床学教研室，贵州 贵阳 550004；2贵州省黔西县公安局)

老年性痴呆症又叫阿尔茨海默病(AD)，该病的主要根源是神经退行性改变，此类患者在行为上会表现出记忆能力变差、智力退化、性格和精神失常、与社会环境格格不入〔1〕。在外观上的表现为老年斑、因持续累积的tau 蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(NFT)及β-淀粉样蛋白(Aβ)增加〔2〕。该疾病的病因及怎样有效预防和治疗暂时还没有达成共识。锌依赖性肽链内切酶类中，对细胞外基质蛋白产生降解作用的是基质金属蛋白酶(MMPs)，许多神经系统疾病，包括帕金森病(PD)及AD在内，其形成都与MMPs相关。该类酶将对应的细胞外基质(ECM)进行分解，在各类细胞的病理及生理活动中对重组及水解两个过程的平衡进行作用。此外，在人体出现炎症时，MMPs的作用也是不可或缺的〔3，4〕。从神经毒性来说，Aβ和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)存在着极大关联。不仅如此，Aβ代谢活动在AD 患者体内所维持的平衡状态会随相关金属离子的状态受 MMP-2作用产生的变化而发生改变，若AD所产生的作用存在于相关过程中，则该蛋白的活力水平必定会发生改变〔5〕。目前，基本上还没有研究得出在AD的形成和治疗过程中缝隙连接蛋白(CX)43和MMP-2、MMP-9的表达之间存在关联。

1 材料和方法

1.1实验动物 雄性NIH小鼠40只，16～24 g。贵州医科大学实验动物中心无特定病原体(SPF)级环境饲养，经实验动物伦理委员会批准。

1.2试剂 D-半乳糖、亚硝酸钠均为市售分析纯；由上海生物工程有限公司设计生产MMP-9、CX43、MMP-2、β-actin定量聚合酶链反应(PCR)的引物；DL2000 DNA Marker购自日本TaKaRa公司；2×Taq PCR Master Mix购自北京TIANGEN 公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)购自德国Roche公司；RNA 逆转录试剂盒购自Thermo公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜和超敏电化学发光试剂盒购自美国Amer-sham公司；封闭液、抗体稀释液、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制剂、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)配制试剂盒及5×蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗CX43单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗MMP-2多克隆抗体、兔抗MMP-9多克隆抗体、兔抗β-肌红蛋白(β-actin)单克隆抗体购自上海Santa Cruz公司。

1.3动物分组及药物处理 小鼠随机分为正常对照组和模型组各10只。正常对照组皮下注射等体积生理盐水，模型组皮下注射D-半乳糖(120 mg/kg)和亚硝酸钠(90 mg/kg)，连续给药60 d，建立痴呆小鼠模型〔6〕。完成注射后，将4%的0.2 ml/g水合氯醛注射进腹腔进行麻醉，剖开胸面，露出心脏，由左心室一直延伸到主动脉用穿刺针穿刺，使用40 ml pH=7.4的磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L)清洁血管床，持续5 min接着剥离大脑组织，-80℃储存。

1.4实时荧光(RT)-PCR检测β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43 mRNA表达水平 用Trizol一步法，提取海马组织中RNA，逆转录成cDNA。β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43对应的引物序列见表1。采用ABI Step One Plus 型RT-PCR仪获取β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43的扩增信号采用SDS2.1软件对数据进行分析及对荧光信息进行获取。β-actin为内参对照，对所得结果进行分析，RQ=2-ΔΔCt，该实验重复3次。

表1 RT-PCR引物序列及产物片段

1.5Western印迹法检测MMP-9、MMP-2及CX43蛋白表达水平 向PMSF：放射免疫沉淀(RIPA)裂解液=1∶100的比例放入海马组织，冷冻离心机4℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液检测目标蛋白质。使用超微量紫外分光光度计N2000型检测各样品蛋白浓度，Image J软件分析图片灰度值，以β-actin蛋白为内参，MMP9、MMP2、CX43的蛋白条带相对内参蛋白条带灰度的比值为检测蛋白的相对表达水平，重复3次。

1.6统计学处理 采用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

相比于正常对照组，模型组CX43、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05，P<0.01)，见表2。

表2 两组CX43、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平

3 讨 论

MMPs是一组降解细胞外基质最主要的酶类〔7〕，1962年，Lapiere和Gross首次发现，在多种内肤酶中存在着一系列根据锌离子相关状况来发挥功能的蛋白酶，也就是MMPs，除了神经元，还有许多不同类型的细胞都能够分泌此类蛋白酶，如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞及神经胶质细胞等〔8〕。一般来说，在人体伤口恢复和发育的过程中，MMPs所起到的作用是非常关键的，但若人体发生了某些疾病，MMPs所产生的作用对病情的发展十分不利，如AD或脑卒中等〔9，10〕。到目前为止，已有超过20种人体自带的MMPs被发现〔11〕。

MMPs的种类较多，其中所起到的影响最大的就是能够对层黏连蛋白、弹性蛋白及明胶等进行分解的MMP-2和MMP-9，在发生水解后，神经细胞会因层黏连蛋白的减少而遭到严重破坏甚至失活。研究表明，AD患者死亡后，解剖尸体发现MMP-9在大脑血管内皮细胞及海马体神经元中呈高表达，因此神经细胞难以实现胶原化。而在脑组织细胞中，MMP-2、MMP-9 的高表达可促进细胞凋亡，损害神经元。Aβ属于三磷酸腺苷(ATP)的分解产物，该物质的降解可通过MMP-9来实现，这一点在体外实验中已经得到了验证，此外，髓鞘碱性蛋白及细胞外基质也会在MMP-9的作用下被彻底分解，更加严重地破坏患者脑部组织〔8〕。信息交流在细胞中的实现主要依靠缝隙连接(GJ)，包括环磷酸腺苷(cAMP)、三磷酸肌醇(IP3)及ATP在内的部分小分子氨基酸等小分子物质及离子等能够穿过其中，该结构由两个半通道相连而成，主要物质为CX，其具有特殊性质。在血脑屏障精细结构的组成中CX43是组成星形胶质细胞缝隙的主要物质，该类结构多存在于中枢神经系统中。缝隙的信息交流水平极大程度上取决于CX43的表达程度，这一点在包括骨髓损伤在内的部分神经病理性疼痛模型中有所体现〔12〕。

虽然NFT及老年斑因Aβ沉积而增多是引发AD的关键原因，但AD是一个多因素相互作用的疾病〔13〕。本实验结果提示CX43及MMP-9表达紊乱在AD小鼠的发病机制中可能起着重要作用。