5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛的高效液相检测方法

刘真，朱丽霞

（塔里木大学生命科学学院南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）

5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛是含氧的呋喃类化合物，作为重要的风味化合物，具有持久的焦糖[1]和水果香味，可使香气丰满、柔和、清润、协调、绵长，广泛存在于食品，姚万欣等[2]研究表明尤其在热加工类食物体系中。冯云超等研究结果表明[3]5-羟甲基糠醛和糠醛是啤酒热负荷指示剂及老化指示剂。Huber[4]研究表明呋喃酮具有较低的阈值，微量的添加就有明显的增香修饰效果，且香味持久，刘晓凤等[5]研究表明可用于调配菠萝、草莓、牛肉等食用香精。凌广轩等[6]研究表明乙酰呋喃广泛应用于食品添加剂。

自然存在的5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛的含量低，常规理化方法难以检测，多以气相色谱－质谱法[7]、气相色谱嗅觉测量法和气相色谱仪。然而在气相色谱－质谱法、气相色谱嗅觉测量法和气相色谱仪测呋喃物质时，因其样品处理方式不同，可分为液液萃取－气相色谱－质谱法[8]和顶空固相微萃取－气相色谱－质谱法[9]。如果采用液液萃取－气相色谱－质谱法，进样口温度过高，会使样品发生美拉德反应，产生呋喃类物质，导致结果偏高；采取顶空固相微萃取-气质联用法时，样品要经过吸附、脱附等过多环节，进样量偏少，且顶空进样需要控制气液平衡，容易受环境波动，无法保证灵敏度和稳定性[10]。多项研究表明[11-13]5-羟甲基糠醛、呋喃酮和糠醛也可以用高效液相检测，其突出优势是简便易操作，灵敏度好，分析速度快，样品处理简单，选择性高。但目前没有将5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛一次性检出的高相液相检测的相关方法报道。由此，本试验拟用高效液相色谱法建立多呋喃物质（5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛）的检测方法，以提供方便、快捷、简单的呋喃类共检出方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

5-羟甲基糠醛（色谱纯）、糠醛（色谱纯）、呋喃酮（色谱纯）、乙酰呋喃（色谱纯）、5-甲基糠醛（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、甲酸（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

岛津高效液相色谱仪：岛津国际贸易（上海）有限公司；Ultimate XB-C18 柱：月旭科技（上海）股份有限公司；Universal32R 高速台式冷冻离心机：德国Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

用分析天秤分别准确称取5-羟甲基糠醛100 mg、糠醛62.4 mg、呋喃酮480 mg、乙酰呋喃64 mg、5-甲基糠醛161.3 mg 放入1 000 mL 容量瓶中，用甲醇（色谱纯）定容成质量浓度分别为 100、62.4、480、64、161.3 mg/L的混合标准溶液备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

以备用混合标准溶液为第一浓度梯度，以5 倍的浓度梯度，依次稀释。配制混标准溶液浓度梯度如表1，以进样量 10 μL 测定。以峰面积（Y）为纵坐标，分别以5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛的质量浓度（X，mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程。混标准溶液浓度梯度见表1。

表1 混标准溶液浓度梯度Table 1 Mixed standard solution concentration gradient mg/L

1.3.3 高效液相检测5 种呋喃物质的方法

色谱柱为Ultimate XB-C 18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为 35 ℃，进样量 10 μL，285 nm 波长，流速0.8 mL/min。以呋喃酮文献检测梯度洗脱条件为参照[13]，见表2。

表2 5 个混标准品的检测梯度洗脱条件Table 2 Detection gradient elution conditions for five mixed standards

1.3.4 5 种呋喃物质回收率及精密度试验

吸取5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛备用混合标准溶液，用甲醇稀释。5-羟甲基糠醛质量浓度为100、4、0.16 mg/L；糠醛质量浓度为62.4、2.49、0.099 6 mg/L；呋喃酮质量浓度为 480、19.2、0.768 mg/L；乙酰呋喃质量浓度为 64、2.6、0.104 mg/L；5-甲基糠醛质量浓度为161.3、6.5、0.26 mg/L。按表2高效液相色谱条件测定，质量浓度每批重复测定5 次，总共3 批，计算回收率。

1.3.5 5 种呋喃物质最低检测线、定量线的测定

3 倍和10 倍噪音值法是色谱仪器中估算检出限和定量限[14]常用的方法，即测量等同于空白溶液测量信号标准偏差3 倍和10 倍的样品浓度或含量为检出限和定量限。将5 种呋喃标品的最低浓度设10 次重复，计算标准偏差，分别以3 倍和10 倍标准偏差为方法得到检出限和定量限。

1.3.6 5 种呋喃物质稳定性试验

准确吸取上述5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛备用混标准液，按表2 色谱条件于0、2、4、6、8、10、12 h 进行测定。

1.4 数据统计分析

按因素分析法对高效液相方法的回收率、精密度、最低检测线、定量线、稳定性等几种因素进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 高效液相检测5种呋喃物质方法

在高效液相色谱检测的脱洗梯度条件下0～2 min，甲醇-0.5%甲酸（15∶85，体积比）；2 min～24 min，甲醇-0.5%甲酸（50∶50，体积比）；24 min～27 min，甲醇-0.5%甲酸（100∶0，体积比）；27 min～29 min，甲醇-0.5 %甲酸（100∶0，体积比）；29 min～33 min，甲醇-0.5 %甲酸（15∶85，体积比）。5 种呋喃物质的检测出峰见图1。

图1 5 种呋喃物质色谱图Fig.1 Five kinds of furan substance chromatogram

如图 1 所示，8.75 min 为 5-羟甲基糠醛；11.56 min为糠醛；14.45 min 为呋喃酮；17.39 min 为乙酰呋喃；19.31 min 为5-甲基糠醛，5 个呋喃物质的分离度和峰型都很好。

2.2 5种呋喃物质标准曲线的制作

5 种呋喃物质的混标准曲线结果见表3。

表3 回归方程、相关系数和浓度线性范围Table 3 Regression equation，correlation coefficient and concentration linear range

5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛的峰面积与对应浓度相关性均在0.999 以上，5-羟甲基糠醛线性关系在0.160 mg/L～100 mg/L；糠醛线性关系在0.099 6 mg/L～62.4 mg/L；呋喃酮线性关系在0.768 mg/L～480 mg/L；乙酰呋喃线性关系在0.104 mg/L～64 mg/L；5-甲基糠醛线性关系在0.260 mg/L～161.3mg/L。

2.3 各组分最低检测线、定量线的测定

检测5 种呋喃物质最低浓度结果见表4。

将5 种呋喃标品的最低浓度设10 次重复，计算标准偏差，分别以3 倍和10 倍标准偏差为方法得到检出限和定量限。结果表明：5-羟甲基糠醛检出限0.153 mg/L、定量限0.154 mg/L；糠醛检出限0.086 mg/L、定量限0.09 mg/L；呋喃酮检出限0.712 mg/L、定量限0.714 mg/L；乙酰呋喃检出限0.094 mg/L、定量限0.091 mg/L；5-甲基糠醛检出限0.240 mg/L、定量限0.250 mg/L。

表4 检测5 种呋喃物质最低浓度结果Table 4 The results of detecting the lowest concentration of five furan substances are shown mg/L

2.4 5种有效成分的回收率及精密度试验结果

回收率试验结果见表5。

表5 回收率试验结果Table 5 The recovery test results are shown

由表5 可见，5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛的回收率分别为97.8 %～99.6 %、95.4%～97.3%、96.3%～97.2%、95.3%～98.3%、94.3%～97.9%。说明该方法准确度高。批内变异系数均小于3%，批间变异系数均小于5%，符合检测要求[15]。

2.5 高效液相检测5种呋喃物质变异系数试验结果

5 种呋喃物质变异系数试验结果见表6。

表6 5 种呋喃物质变异系数试验结果Table 6 The test results of the five furan matter coefficient of variation are shown mg/L

由表6 可以看出，备用混标准品溶液5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛在12 h 内的变异系数分别为3.3 %、4.3 %、0.89 %、5.3 %、1.4 %，5种呋喃物质变异程度小于15%。

2.6 数据统计分析

数据统计分析见表7。

表7 数据统计分析Table 7 Statistical analysis of the data is shown

表7 包括该方法对5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛检测方法的回收率、精密度、检出限、定量限、稳定性。通过数据得知，此方法适合检测5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛。

3 结论与讨论

在参照文献[13]高效液相色谱方法条件的基础上，建立一种多呋喃物质（5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛）的检测方法。结果表明，5-羟甲基糠醛线性关系在0.160 mg/L～100 mg/L 良好，检出限0.153 mg/L、定量限0.154 mg/L，平均回收率为98.6%；糠醛线性关系在0.099 6 mg/L～62.4 mg/L 良好，检出限0.086 mg/L、定量限0.09 mg/L，平均回收率为96.5 %；呋喃酮线性关系在0.768 mg/L～480 mg/L 良好，呋喃酮检出限0.712 mg/L、定量限0.714 mg/L，平均回收率为96.8 %；乙酰呋喃线性关系在0.104 mg/L～64 mg/L 良好，检出限0.094 mg/L、定量限0.091 mg/L，平均回收率为96.7 %；5-甲基糠醛线性关系在0.260 mg/L～161.3 mg/L 良好，检出限 0.240 mg/L、定量限 0.250 mg/L，平均回收率为95.8%。且批内变异系数均小于3%，批间变异系数均小于5%，适合检测样品中5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛5 种呋喃物质含量。

与顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法[16]相比，避免了高温、进样量对结果的影响，气相色谱-质谱法操作环节繁多、复杂，需要控制气液平衡，容易受环境波动。本试验方法样品前处理简单，灵敏度好，简单易操作，大大缩短检测时间。根据目前高效液相检测呋喃类物质[11，17-18]的相关报道，还没有一次性检测多种呋喃物质的方法。本试验检测呋喃类物质不管在精密度、稳定性、回收率、检测量方面占有很大的优势。利用高效液相建立多呋喃物质检测方法时，不但检测出5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛5 种呋喃类物质，与此同时检测了苯乙酸乙酯香气物质，且有出峰效果。