HPLC-MS/MS法测定安神类代用茶中19种镇静安神类非法添加物质

刘国姣，王彬，曾妮，江丰，*，吴婉琴，王会霞，郭晓希，张苗

（1.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北武汉430075；2.湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北武汉430075）

随着生活节奏的加快，越来越多的人面临着失眠的困扰[1-2]。最新调查显示，中国成年人失眠率为38.2%，长期失眠会引发焦虑、抑郁、紧张等情绪，同时有引发糖尿病、高血压等疾病的风险，长期失眠的人死亡率更高[3-5]。为了缓解失眠症状，一些失眠严重的患者常借助于镇静安神类药物来助眠，但考虑到长期服用这类药物会带来较大的副作用损害身体健康，现在更多的人倾向于通过食用一些标示有助眠安神功效的天然食品来减轻症状，例如安神类代用茶、保健食品等，然而不少厂商为了增强产品功效，牟取暴利，擅自在镇静安神类食品中非法添加化学物质，对消费者健康造成极大威胁。常见的安神类非法添加化学物质主要有苯二氮卓类（地西泮、氯氮卓、奥沙西泮、三唑仑、硝西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、劳拉西泮、氯硝西泮、咪哒唑仑等）、酚噻嗪类、抗组胺类（马来酸氯苯那敏等）、巴比妥类（苯巴比妥、司可巴比妥、巴比妥、异戊巴比妥）等，这些物质大部分都是国家严格监管的药物，若使用不当或滥用将造成严重不良后果，且禁止添加在任何食品中。因此，建立一种快速、简单、高效的分析方法对安神类食品的质量安全与相关风险监测工作具有重要的现实意义。

目前普通食品中没有针对镇静安神类化合物的检测标准，只是在镇静安神类中成药及改善睡眠类保健食品中，国家食品药品监督管理局相继出台了对应的补充检验方法和检验项目的批准件，批准件编号分别为2009024、2012004 和2013002，检测项目分别为15 种（分别为地西泮、硝西泮、氯硝西泮、氯氮卓、奥沙西泮、马来酸咪哒唑仑、劳拉西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、氯美扎酮）、4 种（分别为褪黑素、氯苯那敏、佐匹克隆、扎来普隆）和3 种（分别为罗通定、青藤碱、文拉法辛），检测方法均包括薄层色谱法、高效色谱法及高效液相色谱-质谱联用方法，但不同的批准件里涉及的提取溶剂、提取方法、液相、液质条件各不相同，部分提取方法操作复杂，缺乏系统性且无检出限，给日常食品监管带来不便。文献报道的测定镇静安神类非法添加物质的常见检测方法有薄层色谱法[6-8]、液相色谱法[9-12]、液相色谱-串联质谱法[13-20]、气相色谱-串联质谱法[21-24]等。其中，液相色谱-串联质谱法具有定性能力强、选择性好、灵敏度高等优点，近年来，在非法添加物测定中得到了广泛应用，但有关安神类代用茶中安神类非法添加物测定的文献报道少见。本试验以19 种非法添加物质（褪黑素、氯美扎酮、马来酸氯苯那敏、盐酸文拉法辛、硝西泮、艾司唑仑、氯氮卓、扎来普隆、氯硝西泮、劳拉西泮、咪哒唑仑、氯氮平、三唑仑、罗通定、阿普唑仑、青藤碱、佐匹克隆、奥沙西泮、地西泮）为研究对象，建立一种同时测定安神类代用茶中19 种非法添加物的液相色谱-串联质谱法，本方法快速、灵敏，能满足高通量测定食品中多种非法添加物的含量，为政府部门加强食品质量监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

安神茶样品：市售，粉碎均质后待检测。

褪黑素标准品（纯度99.0%）、马来酸氯苯那敏标准品（纯度99.0%）、盐酸文拉法辛标准品（纯度99.0%）、氯硝西泮标准品（纯度99.0%）、劳拉西泮标准品（纯度99.0%）、咪哒唑仑标准品（纯度99.0%）、三唑仑标准品（纯度99.0 %）、罗通定标准品（纯度99.0 %）：Dr.Ehrenstorfer 公司；氯美扎酮标准品（纯度99.9%）、硝西泮标准品（纯度99.8%）、艾司唑仑标准品（纯度99.9%）、氯氮卓标准品（纯度99.8%）、氯氮平标准品（纯度98.7%）、阿普唑仑标准品（纯度98%）、青藤碱标准品（纯度98.0%）、奥沙西泮标准品（纯度99.9%）、地西泮标准品（纯度99.8%）：A ChemTek.Inc 公司；佐匹克隆标准品（纯度98%）、扎来普隆标准品（纯度98%）：Toronto Research Chemical 公司；甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯）：赛默飞世尔科技有限公司；水（色谱纯）：Millipore 公司。

1.2 仪器与设备

API 4500 型三重四极杆串联质谱仪：美国AB SCIEX 公司；UltiMate 3000 高效液相色谱仪：美国戴安公司；ME2002E/02 型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Allegra X-15R 型低速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；Elmasonic S180H 超声仪：Elma Hans Schmidbaner GmbH&Co.KG 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液的配制

标准储备溶液的配制：准确称取适量的褪黑素、氯美扎酮、马来酸氯苯那敏、盐酸文拉法辛、硝西泮、艾司唑仑、氯氮卓、扎来普隆、氯硝西泮、劳拉西泮、咪哒唑仑、氯氮平、三唑仑、罗通定、阿普唑仑、青藤碱、佐匹克隆、奥沙西泮、地西泮标准品，用甲醇溶解并定容，分别配制成0.1 mg/mL 的单一标准储备溶液，密封，于4 ℃保存。

混合标准品溶液的配制：取上述标准品储备溶液适量，根据各物质的响应信号强度的不同用甲醇释至相应的浓度范围的混合标准溶液。

1.3.2 样品前处理

精确称取样品约1 g（精确到0.001 g）于50 mL 的具塞离心管中，加入25 mL 乙腈，于25 ℃超声提取20 min，在 4 000 r/min 离心分离 5 min，取上清液 10 mL，用水稀释至20 mL，用0.22 μm 滤膜过滤，供高效液相色谱-质谱仪检测用。

1.3.3 液相色谱-质谱分析条件

色谱条件：采用ACE Excel 2 C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，流速 0.3 mL/min，流动相：A 为 0.1%甲酸水溶液，B 为甲醇。柱温30 ℃，进样体积5 μL，梯度洗脱条件见表1。

质谱条件：正离子模式扫描；离子源：电喷雾离子源（ESI 源）；检测方式：多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压（IS）：5 500 V；气帘气（CUR）：35 psi（1 psi=0.006 89 MPa）；雾化器（GS1）：55 psi；辅助气（GS2）：55 psi；离子源温度（TEM）：500 ℃。优化后的质谱参数见表2。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Conditions of gradient elution

表2 19 种非法添加物质的质谱参数Table 2 Monitored ions，declustering potential and collision energy of 19 kinds of illegal additives

续表2 19 种非法添加物质的质谱参数Continue table 2 Monitored ions，declustering potential and collision energy of 19 kinds of illegal additives

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

参照国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件2009024、2012004、2013002中流动相的条件。本方法比较了甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L 醋酸铵溶液（含0.1%甲酸）、乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-5 mmol/L 醋酸铵溶液（含0.1%甲酸）分别作为流动相时，对19 种待测化合物的色谱分离和质谱灵敏度的影响。结果显示，选择甲醇-5 mmol/L 醋酸铵溶液（含0.1%甲酸)和乙腈-5 mmol/L 醋酸铵溶液（含0.1%甲酸)作为流动相时各分析物的响应比甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时响应低，且甲醇-0.1%甲酸水比乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时各物质间的分离效果更好，且青藤碱的峰形得到改善，因此，本方法选择甲醇-0.1%甲酸水作为流动相。

2.2 提取溶剂的选择

根据19 种目标分析物的结构特性和化学性质，本试验考察了甲醇、乙腈、酸化甲醇（含0.1%甲酸），酸化乙腈（含0.1%甲酸）分别作为提取溶剂时对19 目标分析物提取效果的影响，结果见图1。

如图1 所示，19 种目标分析物均在乙腈作为提取溶剂时具有更好的提取效果，其中在甲醇和乙腈中加入0.1%甲酸对各目标物的回收率无明显影响，因此，选择乙腈作为提取溶剂。

图1 提取溶剂对回收率的影响Fig.1 Effect of extracted solvents on recovery rate

2.3 方法线性范围及检出限

根据各目标分析物响应强度的不同，分别吸取一定体积的各目标分析物的标准溶液，用空白样品的基质溶液稀释，配制成一系列不同质量浓度的标准溶液。以目标物色谱峰的峰面积为纵坐标，化合物的质量浓度为横坐标绘制标准曲线。结果见表3。

结果表明褪黑素、氯美扎酮、青藤碱、奥沙西泮、劳拉西泮、氯氮卓在质量浓度为1 ng/mL～100 ng/mL；马来酸氯苯那敏、罗通定、硝西泮、地西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、扎来普隆、三唑仑、盐酸文拉法辛在质量浓度为0.5 ng/mL～50 ng/mL；氯氮平、咪哒唑仑在质量浓度为0.2 ng/mL～20 ng/mL；佐匹克隆在质量浓度为5 ng/mL～500 ng/mL 范围内线性良好。根据以3 倍基线噪声所对应的浓度作为测定方法的检出限，10 倍基线噪声所对应的浓度作为测定方法的定量限，得出各目标分析物的检出限和定量限，满足19 种非法添加物质高灵敏度检测的需要。

表3 19 种非法添加物质的线性范围、回归方程、线性范围、检出限和定量限Table 3 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，detection limit and quantification limit of 19 kinds of illegal additives

2.4 回收率及精密度试验

为了考察本方法的可行性，在本试验条件下，向安神类代用茶空白基质中添加低、中、高3 个水平浓度的19 种安神类非法化学添加物质混合标准溶液，每组添加6 个平行，回收率及精密度结果见表4。

表4 加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 4 Recoveries and relative standard deviation of spiked samples

续表4 加标回收率和相对标准偏差（n=6）Continue table 4 Recoveries and relative standard deviation of spiked samples

续表4 加标回收率和相对标准偏差（n=6）Continue table 4 Recoveries and relative standard deviation of spiked samples

由表4 可知，6 次试验结果的回收率均在80.5%～108.8%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于 10%。

2.5 安神茶样品测定

对采购的20 批次标注有安神助眠功能的代用茶按照本研究方法进行前处理和分析检测，结果表明，20批次的安神茶中均未检测出19 种非法添加物。

3 结论

本研究基于高效液相色谱-串联质谱技术建立了快速测定安神类代用茶中褪黑素等19 种非法添加物的检测方法，19 种分析物在其相应的浓度范围内峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数（R2）均大于 0.99，该方法的检出限为 10 μg/kg～200 μg/kg，定量限为 30 μg/kg～600 μg/kg，样品的回收率为 80.5 %～108.8%。本方法简单易行，灵敏度高，是一种高效且低成本的检测方法，方法的准确度、精密度及灵敏度均满足日常检测要求，可适用于实验室大批量的代用茶样品检测，为食药监部门提供强有力的技术支持，保障人民群众的食品安全。