大头菜发酵过程中生香酵母的分离、筛选及鉴定

黄鑫，唐红梅，唐青莲，刘阳，*，邓静

（1.四川旅游学院，四川成都610100；2.四川理工学院，四川自贡643000）

大头菜又名根用芥菜、辣疙瘩、诸葛菜[1]，广泛种植于中国西部地区。它富含维生素、膳食纤维和大量的微量元素、糖类、蛋白质等[2]，可促进结肠蠕动，防止便秘[3]。大头菜皮厚，肉质致密坚实，水分少且具有强烈的辛辣味和少许苦味，不宜生吃，因此，多通过腌制进行加工食用[4]。腌制大头菜一般经选料、初晒、拌料、复晒、加料、密封和腌制等工序加工而成，经60 d～90 d发酵后成熟[5]。大头菜经腌制加工后，组织脆爽、风味独特、营养丰富，深受消费者欢迎[6]。目前，对大头菜的研究主要集中于挥发性风味物质[7]、工艺[8]、乳酸菌[9]等方面，但对发酵过程中生香酵母的研究较少。

生香酵母是一类能够代谢产生香气成分的酵母菌的总称，发酵过程中除参与醛缩醇类、含硫化合物等香气成分的生成外，还一定程度地参与氨基酸和有机酸类的生成，因此能显著增加食品的香气成分[10]。目前，对生香酵母的研究应用较多，但主要集中在酒类[11]、调味品[12]、面制品[13]及其特性研究上。Jie Feng 等[14]从酱油中分离出一株嗜盐生香酵母（Candida etchellsii），利用高效液相技术与气质联用技术对酵母产生的有机酸、氨基酸、挥发性风味物质进行了分析。A Cadière 等[15]采用一种以葡萄糖酸酯为唯一碳源的自适应进化策略，获得了具有改良特性的葡萄酒酵母。

本试验从腌制大头菜的发酵液中筛选生香酵母，通过形态学、生理生化试验及18S rDNA 对菌株进行分类鉴定，为生香酵母在大头菜中的研究与应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料来源

腌制大头菜发酵液：四川内江威宝食品有限公司。

1.1.2 仪器设备

SHP0201147047 型电子分析天平：上海恒平科学仪器有限公司；BH200 型光学显微镜：宁波舜宇仪器有限公司；SW-CJ-IF 型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；SM530C 型立式压力蒸汽灭菌锅：成都盛德先华科贸有限公司；LRH-250 型生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；QYC-2102C 型摇床：上海福玛实验设备有限公司；201-3AB 型电热恒温干燥箱：余姚市东方电工仪器厂；S1000 型PCR 扩增仪：美国BIO-RAD公司；DY-6C 型电泳仪：北京市六一仪器厂；Gel Doc 2000型凝胶成像系统：美国BIO-RAD 公司。

1.1.3 主要试剂

蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、孟加拉红、氯霉素、乙醇、酵母膏、琼脂粉、亚甲基蓝、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、硝酸钾、尿素、溴甲基酚紫、酚红、氢氧化钾、品红、异戊醇、乙醇、溴化乙锭（EB）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。

1.1.4 培养基

孟加拉红固体培养基：蛋白胨0.5%，琼脂2%，葡萄糖1%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，1/3000 孟加拉红溶液10 %，补足蒸馏水，分装后121 ℃灭菌20 min，氯霉素0.01%，用少量乙醇将氯霉素溶解，加入已灭菌的45 ℃～50 ℃培养基中。

YPD 培养基：蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，酵母膏0.1%，自然pH 值。

PDA 培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，自然pH 值。

碳源同化基础培养基：酵母膏0.02%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钙0.01%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.05%，氯化钠0.01%，糖或其它碳源0.5%，自然pH 值。

氮源同化基础培养基：磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，酵母膏0.02%，氮源0.5%，葡萄糖2%，自然pH 值。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离

取腌制大头菜发酵液1.0 mL 注入9 mL 无菌水中，制成 1∶10 的样品匀液。再吸取 1 mL 1∶10 的样品匀液注入9 mL 无菌水中，制成1∶100 的样品匀液。按上述操作制备10 倍系列稀释样品匀液。分别吸取各稀释度的样品匀液0.1 mL，无菌环境下在孟加拉红培养基上涂布分离，于28 ℃恒温培养箱中培养48 h，挑取与酵母菌菌落形态相符的单个菌落再于PDA 与YPD 培养基上划线，纯化2 次，观察菌落形态，确定为单菌落后将所分离的酵母菌转接于PDA 和YPD 试管斜面培养基上，于4 ℃生化培养箱保存[16]。

1.2.2 生香酵母的筛选

挑选纯化培养后的单菌落点种于YPD 培养基和PDA 培养基上，28 ℃培养24 h，仔细观察菌株形态并进行记录，并分别挑取YPD 培养基和PDA 培养基上的单菌落接种于50 mL YPD 液体培养基和50 mL PDA液体培养基上，于28 ℃下恒温培养24 h～72 h，采用嗅闻法判断产香情况[17]。

1.2.3 菌株形态学鉴定

参照《真菌鉴定手册》[18]以及《酵母菌的特征与鉴定手册》[19]对生香酵母进行形态学和生理生化鉴定，初步确定其分类地位。

1.2.3.1 菌落形态观察

按无菌操作将各个菌株点种于YPD 培养基、PDA培养基以及孟加拉红培养基上，28 ℃培养48 h，观察菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度等，作好记录[20]。

1.2.3.2 细胞形态观察

取洁净载玻片，加入0.1 mL 美蓝染液，接种环挑取少量菌体在载玻片上涂匀，染色15 min～20 min，用流水冲洗载玻片至流出水无色，吸水纸吸干残留水分，晾干。于100 倍油镜下观察，形态、大小、有无孢子等，记录并拍照。

1.2.4 生理生化试验鉴定

通过糖发酵试验、碳源同化试验、氮源同化试验、分解尿素试验对已分离出的生香微生物进行鉴定，从而确定其生理生化特性，初步判断菌株的种属。

1.2.5 菌株分子鉴定

18S rDNA 是真核生物中编码的核糖体小亚基的DNA 序列，其为微生物种群的区分、鉴定以及生物进化关系的研究提供了极大的可能[21]。将待测菌株接种于 YPD 液体培养基中，28 ℃、180 r/min 培养 48 h，过滤，收集菌体，采用十二烷基硫酸钠-十六烷基三甲基溴化铵方法（SDS-CTAB）提取菌株的总DNA，采用真菌 18S rDNA 通 用 引 物 对 NS1 和 NS8 （NS1：5′ -GTAGTCATATGCTTGTCTC -3′；NS8：5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′）对菌株进行聚合酶链式反应（PCR）扩增[22]。50 μL PCR 反应体系为：50 μg 模板、5 μmoL 正反引物、50 μmol/L dNTP、5 μL 10×PCR 缓冲物（MgCl2）、2.5 U E×Taq DNA 聚合酶，无菌纯水补齐到50 μL。PCR 扩增条件[17]：94 ℃预变性 10 min，94 ℃变性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 30 个循环，最后72 ℃补平7 min，终止温度4 ℃。

将PCR 扩增产物送至检测机构进行测序。利用NCBI 对测得序列进行BLAST 同源性比对，并利用MEGA 7.0 绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 生香酵母的筛选

经1.2.1 筛选得9 株菌，经过YPD、PDA 培养纯化后，编号为 J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8、J9。为进一步筛选，对9 株菌的生香能力进行测试，结果见表1。

在 PDA 培养基中，J1、J5、J7、J9 产生的香气较强，J3、J8 产生的香气一般，J2、J6 产生的香气较弱，J4 则不产香；在 YPD 培养基中，J5 产生的香气较强，J1、J3、J7、J8、J9 产生的香气一般，J6 产生的香气较弱，J2 不产香。通过嗅闻法，初步选定 J1、J3、J5、J7、J8、J9 这 6株生香能力较强的菌株进行下一步鉴定。

表1 9 株菌生香能力研究Table 1 The ability to study 9 strains of aroma-producing yeast

2.2 菌株形态学鉴定

将生香能力较强的6 株菌点种于PDA 培养基上，28 ℃培养48 h，观察菌落形态；利用美蓝染色，于100倍油镜下观察细胞形态，结果见图1。根据《真菌鉴定手册》与《酵母菌的特征与鉴定手册》对各菌株的形态进行描述，结果见表2。

2.3 生理生化鉴定

对已纯化培养后的6 种单菌株进行生理生化试验，得到试验结果如表3，根据试验结果，确定其生理特征，从而得出菌株的种类。

由表3 可知，J1 可以发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，可以同化乙醇、可溶性淀粉、硝酸钾、硫酸铵，能够分解尿素；J3 可以发酵葡糖、蔗糖、麦芽糖，可以同化乙醇、可溶性淀粉、硝酸钾、硫酸铵，能够分解尿素；J5 可以发酵葡萄糖、蔗糖，可以同化乙醇、硫酸铵；J7 可以发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，可以同化乙醇、可溶性淀粉、硝酸钾、硫酸铵，可以分解尿素；J8 可以发酵葡萄糖、麦芽糖，可以同化乙醇、可溶性淀粉、硫酸铵；J9 可以发酵葡萄糖、蔗糖，可以同化乙醇、硫酸铵。

图1 菌株的菌落形态和细胞形态Fig.1 The colony morphology and cell morpholopy of strains

表2 菌株形态描述Table 2 The description of morphology of strains

表3 生理生化试验结果Table 3 The results of physiological and biochemical test

根据《酵母菌的特征与鉴定手册》、《真菌鉴定手册》并结合图 1，表2、3，可以初步判断 J1、J3、J7 为奥默柯达毕赤酵母属，J5、J9 为毕赤酵母属，J8 为假丝酵母属。

2.4 菌株分子鉴定

将筛选得出的6 株生香酵母进行18S rDNA 基因序列测定，各菌株基因序列检测结果见表4。使用DNASTAR 以及CHROMAS 峰图将相同属菌株基因序列进行比对，得出 J1、J3、J7 属于同一菌种，J5、J9 属于同一菌种，J8 为一个菌种。

将 J1、J5、J8 的 18S rDNA 基因序列输入美国国立生物技术信息中心（NCBI）中进行核苷酸序列比对检索（BLAST）比对，选取同源性较高的模式菌株运用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，且Bootstrap对进化树进行1 000 次可信度分析，见图2。具体鉴定结果见表5。

由表5、图2 可以看出，J1 与奥默柯达酵母（Ko－damaea ohmeri）（KY684065.1）处于同一分支上，且同源性为100%，因此J1 鉴定为Kodamaea ohmeri。J5 与季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）（MG846137.1）处于同一分支，同源性为99%，最终确定J5 为 Meyerozyma guilliermondii。J8 与热带假丝酵母（Candidatropicalis）（MG599246.1）处于同一分支，同源性仅为87%，可能是新发现的Candidatropicalis。

表4 菌株18S rDNA 基因序列Table 4 The genetic sequence of 18S rDNA

表5 18S rDNA 菌种鉴定Table 5 The identification of 18S rDNA strain

图2 菌株18S rDNA 序列系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree of 3 kinds of fungi based on 18S rDNA sequence

3 结论

从腌制大头菜的发酵液中分离出9 株酵母菌，经过产香特性的比较选取产香能力较强6 株菌进行形态学、生理生化试验及18S rDNA 鉴定。结果表明：J1、J3、J7 属于同种菌株，为奥默柯达酵母（Kodamaea ohmeri）；J5、J9 属于同种菌株，为季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）；J8 为热带假丝酵母（Candidatropicalis）。目前，对于大头菜发酵过程中生香酵母的研究还处于起步阶段，生香酵母的筛选鉴定、生香特性、耐盐机理的研究、菌剂的制备等领域均未见文献报道。因此，本研究结果为大头菜中生香酵母的进一步研究提供参考依据。