深裂竹根七中酚类化合物种类与含量分析

李开金，冯婷婷，黄晔，林奇泗

（徐州医学院药学院，江苏徐州221004）

深裂竹根七[Disporopsis pernyi（Hua）Diels]为百合科竹根七属植物，它生长在海拔500 m～2 500 m 的南亚地区[1]。这种植物具有悠久的药用历史，用于治疗慢性咳嗽、炎症等病症，但尚未被成功地进行人工栽培[2]。根据本课题组以往的研究表明，深裂竹根七乙酸乙酯提取物的抗氧化和抗菌作用强于氯仿、石油醚和正丁醇提取物，且其酚酸成分的活性较强[3]。因此，本研究选择深裂竹根七的乙酸乙酯提取物为研究对象。曾有文献报道，从深裂竹根七中分离出了芦丁、木犀草素、槲皮素和桦木酸[4-5]。而液质联用检测是酚类化合物分析的重要分析技术之一。其中飞行时间质谱（time-offlight mass spectrometry，TOF-MS）可以在宽动态范围内提供极好的质量准确度[6]。因此本研究采用液质联用方法对这4 种酚酸成分进行检测，验证其是否存在于乙酸乙酯提取物中，并用超高效液相色谱进行含量测定。

1 仪器与材料

新鲜的深裂竹根七于2016年8 月从高山地区采集，地址位于贵州省（经度 106°56′～106°68′E；纬度26°42′～26°43′N；海拔 1 000 m～1 600 m）。将干燥的植物原料粉碎，过二号筛，风干备用。

没食子酸（批号110831-201704）、芦丁（批号100080-201707）、木犀草素（批号 111520-201704）、槲皮素（批号100081-201703）、桦木酸（批号100135-201707）：中国药品生物制品检定所；福林酚试剂（色谱纯）：上海阿拉丁化学试剂有限公司；乙腈（色谱级）：Caledon 实验室（加拿大乔治敦）；超纯水：杭州娃哈哈集团；乙醇、乙酸乙酯、甲醇等试剂均为分析纯：山东禹王试剂公司。

Shimadazu Nexera X2 30A 超高效液相色谱：日本岛津公司；BSA124S 型电子分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；TG332A 型微量分析天平：上海分析天平厂；Agilent UPLC/Q-Tof 液质联用仪、Agilent1200系列高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司。

2 方法

2.1 乙酸乙酯提取物制备

深裂竹根七风干粉末（50 g）用500 mL 70%乙醇在90 ℃下提取1 h，重复3 次。合并滤液，将滤液于60 ℃下旋转蒸发至无醇味。以乙酸乙酯为溶剂，采用液-液萃取法萃取乙醇提取物。用旋转蒸发器减压蒸发得到乙酸乙酯萃取物（ethyl acetate extraction，EAE）。EAE 的收率为1.9%，将其保存于4 ℃下备用。

2.2 总酚含量的测定

2.2.1 标准曲线的绘制

参考文献方法[7-8]，以没食子酸为对照品，用Folin-Ciocalteu 比色法测定EAE 中总酚含量。分别取100、200、300、400、500 mg/L 没食子酸 80%甲醇溶液 50 μL，分别与 450 μL 的蒸馏水和 2.5 mL Folin-Ciocalteu 试剂混合。5 min 后，加入 2 mL 饱和碳酸钠（75 g/L）在30 ℃间歇振荡培养1.5 h 后，在765 nm 处测量所得蓝色溶液的吸光度。以含量为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线和回归方程。

2.2.2 供试品含量的测定

取EAE 适量溶解在甲醇中定容，取50 μL 按2.2.1项下方法操作，测定吸光度，代入回归方程计算。总酚含量以没食子酸干燥物质量计，单位为mg/g。

2.3 液质联用法鉴别EAE 中酚酸

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相A 和B 分别为水和乙腈，梯度程序为：95 %～90 % A 保留 10 min，90 %～60 % A 保留30 min，60 %～40 %A 保留 10 min，40 %～30 %A 保留5 min，30 %～20 %A 保留 10 min，20 %～10 %A 保留5 min，10%A 保留10 min。每次分析后再平衡时间为10 min。流速为 1.0 mL/min；进样量 5 μL。

2.3.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），分析的参数设置在负离子模式下，在从M/Z 50～1 000的质量范围内获得的光谱。最佳ESI-MS 参数为：毛细管电压3.5 kV，干燥气体温度180 ℃，干燥气体流量8 L/min，雾化气体压力1.2 psi（1 psi=0.006 89 MPa）。

2.3.3 对照品溶液配制

精密称取芦丁、木犀草素、槲皮素和桦木酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成浓度约为1.0 mg/mL的对照品溶液，作为储备液。

2.3.4 样品检测

取2.3.3 项下各对照品储备液0.1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液在上述色谱和质谱条件下进样分析。

供试品溶液的制备：精密称取2.1 项下EAE 适量，加入色谱纯甲醇溶解定容，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液在2.3.1 项下色谱和2.3.2 项下质谱条件进样分析。

2.4 超高效液相色谱分析4 种酚酸含量

2.4.1 色谱条件

色谱柱为 Shim-pack XR-ODS column （1.6 μm，75 mm×2.0 mm）；柱温：30 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：5 μL；二极管阵列检测器 Photodiode Array Detector；检测波长：210、254 nm 和 280 nm。流动相 A 和 B 分别由0.1 % 甲酸溶液（pH 2.4）和乙腈组成。梯度顺序为：95 %A 保留 2 min；95 %～90 %A 保留 2 min；90 %～60 %A 保存 6.5 min；60 %～40 %A 保存 2 min；40 %～30 %A 保存 1 min；30 %～20 %A 保存 2 min；20 %～10 %A 保存 1 min；10%A 保存 3 min。每次分析后再平衡时间为10 min。

2.4.2 标准曲线绘制

分别精密量取2.3.3 项下4 种酚酸对照品储备液适量，加甲醇溶解并逐级稀释至刻度，制成系列浓度的对照品溶液，按2.4.1 项下条件进样，记录色谱图。以各色谱峰的峰面积A 为纵坐标，质量浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准工作曲线，计算回归方程。

2.4.3 方法学考察

分别考察精密度、重现性、24 h 内的稳定性及回收率。

2.4.4 样品含量测定

分别精密称定3 批2.1 项下EAE 适量，加甲醇配制成溶液，按2.4.1 项下条件进样，将峰面积代入回归方程，计算含量。

3 结果与讨论

3.1 总酚含量

提取物中的总酚含量由校准曲线导出的回归方程（y=24.02x-0.053，R＝0.999 3）。将样品吸光度代入回归方程计算，EAE 含量为（35.3±1.03）mg/g。结果表明，深裂竹根七乙酸乙提取物中含有大量的酚类化合物。

3.2 液质联用法分析酚酸成分

用反相高效液相色谱与电喷雾电离串联质谱分析法从EAE 检测出了4 种酚类化合物，因为使用的是负离子模式，故所得的离子为[M-H]-。所获得的离子流图如图1 所示，数据见表1。

图1 基峰离子流图Fig.1 The base peak chromatogram

表1 EAE 中4 种成分峰的HPLC-ESI Q-TF-MS 数据Table 1 HPLC-ESI-Q-TOF-MS data for EAE

3.3 超高效液相色谱法测定4种酚酸含量

测定将供试品峰面积代入回归方程，方法学考察和回归方程见表2，色谱图见图2。

深裂竹根七乙酸乙酯提取物中芦丁、木犀草素、槲皮素和桦木酸的含量分别为 （5.63±0.15）、（2.51±0.10）、（3.87±0.12）、（2.41±0.09）μg/g，结果以干重计。

本研究采用反相高效液相色谱与电喷雾电离串联质谱分析联用技术对深裂竹根七EAE 中4 种酚类化合物进行了分离和鉴定。质谱法检测的优点包括确定分子量和获得结构信息的能力。酚类化合物的响应灵敏度对负离子极性较好，因为酚类化合物的酚羟基或羧基容易与溶液中的阴离子解离。因此，采用了负离子模式进行分析。

表2 4 种化合物的方法学考察Table 2 Methodology of the four analytes

图2 乙酸乙酯提取物超高液相色谱图Fig.2 UPLC chromatogram of EAE

本研究采用UPLC 法测定了深裂竹根七中的芦丁、木犀草素、槲皮素和桦木酸4 种成分含量。这4 种组分曾被文献报道用系统分离法分离得到。故而本研究针对这4 种成分建立含量测定方法。曾使用高效液相法测定这4 种成分，需要费时90 min，而改用UPLC法只需20 min，大大节省了检测时间。