银耳多糖乙酰化修饰及其抗氧化活性

徐兵，陆灏钰，徐倩，陈义勇

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

银耳（Tremella fuciformis）又名白木耳，含有酚类、黄酮类及膳食纤维等[1]物质，银耳多糖（polysaccharides from Tremella fuciformis，TFP）是银耳的主要活性成分[2]，近年来，国内外研究发现，银耳多糖具有免疫调节[3]、抗肿瘤[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]等功能，分子修饰对多糖活性有很大的影响[7]。至今已发现多糖的活性与其结构有着密切的关系，经过乙酰化修饰的多糖水溶性增加，生物活性得到明显的增强[8]。然而目前，银耳多糖的修饰主要集中在磷酸化[9]、硫酸化[10]等方面，对银耳多糖乙酰化修饰工艺的研究尚未见报道。为了进一步研究银耳多糖乙酰化修饰及其抗氧化活性，本文研究了乙酸酐用量、反应时间和反应温度对TFP 乙酰化反应的影响，并利用响应面法对TEP 乙酰化化修饰工艺条件进行优化，同时探讨采用IC50法（自由基清除率）测定乙酰化银耳多糖（acetylated polysaccharides from Tremella fuciformis，Ac-TFP）的抗氧化活性。旨在为乙酰化银耳多糖的工业化制备奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

银耳：市售；1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）：上海楷阳生物技术有限公司；三羟甲基氨基甲烷（trihydroxymethyl aminomethane，Tris）：上海楷阳生物技术有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、乙酸酐、盐酸、过氧化氢、硫酸亚铁、水杨酸、酚酞、邻苯三酚等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DJ-04 粉碎机：上海淀久中药机械制造有限公司；HH-2 智能数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；CR22GⅡ高速冷冻离心机：日本HITACHI 公司；RE-52A 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器有限公司；Alpha 1-2 LD 冷冻干燥机：德国 CHRIST 公司；ME104E 型分析天平、FE20 型 pH 计：瑞士 METTLER TOLEDO 公司。

1.3 方法

1.3.1 银耳多糖的制备

银耳经过干燥，然后机械粉碎，并过60 目筛，获得银耳粉。将银耳粉末与蒸馏水按照料液比1∶50（g/mL），90 ℃条件下水浴浸提6 h，浸提液离心（4 500 r/min）10 min，合并上清液。将上清液减压浓缩至一定体积，加入浓缩后体积的1/4 的Sevage 试剂（正丁醇∶三氯甲烷=1∶4，体积比），搅拌 0.5 h，将其混匀，然后离心（4 500 r/min）10 min，得到上清液，加入4 倍体积的95%的乙醇，在4 ℃条件下醇沉24 h，离心，沉淀冷冻干燥后得到TFP 备用。

1.3.2 乙酰化银耳多糖（Ac-TFP）的制备

参考宋逍等[11]的方法并适当调整。精确称取100 mg TFP 样品，溶解在10 mL 的蒸馏水中，用氢氧化钠溶液（0.5 mol/L）调节pH 值至9。在30 ℃条件下，向多糖溶液滴加一定量的乙酸酐，滴加完毕后，恒温反应2 h，待反应结束，用1 mol/mL 的HCl 将反应液的pH 值调至7.0，将反应液装入截留分子量为15 000 kD 的透析袋中，用蒸馏水透析48 h，透析液经减压浓缩后，用4 倍体积分数为95%的乙醇醇沉24 h，沉淀冷冻干燥即为乙酰化银耳多糖（Ac-TFP）。

1.3.3 乙酰化取代度（degree of substitution，DS）的测定

称取TFP10 mg，溶解在10 mL 的0.01 mol/L 的NaOH 溶液中，以酚酞作为指示剂（1 ～2），并用0.01 mol/L 的HCl 溶液滴定至红色退去。记录滴定时的HCl 用量，并按下列公式计算出取代度[12]：

式中：A 为乙酰基含量，%；V0为加入 NaOH 溶液的体积，mL；C0为加入 NaOH 溶液的浓度，mol/L；V1为消耗 HCl 溶液的体积，mL；C1为 HCl 溶液的浓度，mol/L；m为样品质量，g。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 乙酸酐用量对TFP 乙酰化反应的影响

精确称取100 mg 的TFP，在反应时间3 h，反应温度 60 ℃的条件下，探讨乙酸酐用量（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL）对TFP 乙酰化反应的影响，确定最佳乙酸酐用量。

1.3.4.2 反应时间对TFP 乙酰化反应的影响

精确称取100 mg 的TFP，在乙酸酐用量3.0 mL，反应温度 60 ℃的条件下，探讨反应时间（1、2、3、4、5 h）对TFP 乙酰化反应的影响，确定最佳反应时间。

1.3.4.3 反应温度对TFP 乙酰化反应的影响

精确称取100 mg 的TFP，在乙酸酐用量3.0 mL，反应时间 3 h 的条件下，探讨反应温度（20、30、40、50、60、70 ℃）对TFP 乙酰化反应的影响，确定最佳反应温度。

1.3.5 响应面试验设计

根据单因素试验的结果，通过响应面试验设计，以取代度值为指标，以反应时间、反应温度和乙酸酐用量为3 个因素，设计三因素三水平的响应面试验，优化TFP 乙酰化修饰工艺条件。

1.3.6 Ac-TFP 的结构表征

分别以干燥的 TFP 和 Ac-TFP 粉末与KBr 为1∶1 000 的质量比例进行研磨，充分混匀后压片，在波长为4 000 cm-1～400 cm-1的范围下进行红外光谱扫描，比较TFP 和Ac-TFP 的红外光谱图。

1.3.7 抗氧化活性测定

1.3.7.1 ·OH 清除能力测定

分别向试管中加入1 mL 9.0 mmol/L 的FeSO4、1 mL 9.0 mmol/L 的水杨酸乙醇溶液，摇匀，然后分别加入1 mL 的不同浓度的修饰后的 Ac-TFP 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L） 和 1 mL 不同浓度的修饰前的 TFP 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L），充分混匀后，加入 1 mL 8.8 mmol/L 的 H2O2，混匀，置于 37 ℃水浴锅中水浴30 min 进行反应，以蒸馏水作为参比，在波长为510 nm处测定各反应溶液的吸光度值Ai。空白对照组以相同体积蒸馏水替代多糖样品测吸光度值。并按照下列公式进行计算·OH 的清除率[13]。

式中：Ai为不同浓度TFP 和Ac-TFP 的吸光度值；Aj为水杨酸以蒸馏水为替代物的吸光度值；A0为不同浓度TFP 和Ac-TFP 以蒸馏水为替代物的吸光度值。

1.3.7.2 DPPH 自由基清除能力测定

分别将2 mL 的不同浓度的TFP 和Ac-TFP 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L） 和 2 mL 浓度为 0.1 mmol/L的DPPH 溶液振荡摇匀，摇匀后于25 ℃左右下避光反应30 min，在波长为517 nm 处测定吸光度值，并按照下列公式进行计算DPPH 自由基的清除率[14]。

式中：A2为不同浓度TFP 和Ac-TFP 的吸光度值；A1为不同浓度TFP 和Ac-TFP 以蒸馏水为替代物的吸光度值；A0为DPPH 以蒸馏水为替代物的吸光度值。

1.3.7.3 O2-·清除能力测定

在试管中加入 4.5 mL 的 Tris-HCl 缓冲液（50 mmol/L，pH8.2）、1 mL 不同浓度的 TFP 和 Ac-TFP溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）及 3.2 mL 蒸馏水，摇匀后在25 ℃的水浴锅中水浴20 min，再加入0.3 mL 的7 mmol/L 的邻苯三酚溶液，置于25 ℃的水浴锅中反应3 min，随即用10 mol/L 的HCl 溶液终止反应，并在波长为325 nm 处测定吸光度值为A。空白对照组以蒸馏水代替多糖样品，测得的吸光度值为A0。并按照下列公式计算O2-·的清除率[15]。

式中：A 为不同浓度TFP 和Ac-TFP 的吸光度值；A0为不同浓度TFP 和Ac-TFP 以蒸馏水为替代物的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 乙酸酐用量对TFP 乙酰化反应的影响

乙酸酐的用量对TFP 乙酰化反应的影响见图1。

从图1 中可知，TFP 乙酰基的取代度先是呈上升趋势，在乙酸酐用量为3 mL 时，达到最大值，继续增加乙酸酐的用量，TFP 乙酰基的取代度开始下降。这可能是因为随着乙酸酐用量的增多，增加了TFP 乙酰化反应的几率，乙酰基取代度随之增大，但是当乙酸酐的用量过多时，增大了乙酸酐水解的副反应程度，反应体系的pH 值逐渐下降，从而导致TFP 乙酰基的取代度逐渐下降。

图1 乙酸酐用量对TFP 乙酰基取代度的影响Fig.1 Effect of acetic anhydride amount on substitution degree of Ac-TFP

2.1.2 反应时间对TFP 乙酰化反应的影响

反应时间对TFP 乙酰化反应的影响见图2。

图2 反应时间对TFP 乙酰基取代度的影响Fig.2 Effect of reaction time on substitution degree of Ac-TFP

从图2 中可知，TFP 乙酰基的取代度随着反应时间的增加而增大，但是在反应时间超过2 h 之后，继续延长反应时间，TFP 乙酰基取代度迅速降低，这可能是因为Ac-TFP 产物在体系中并不稳定，随着反应时间的延长，增加了反应物之间的碰撞几率，部分产物发生了分解，引起乙酰化程度降低。

2.1.3 反应温度对TFP 乙酰化反应的影响

反应温度对TFP 乙酰化反应的影响见图3。

由图3 可知，在 30 ℃～60 ℃的温度范围内，TFP 乙酰基取代度逐渐增大，在反应温度超过60 ℃，TFP 乙酰基的取代度开始变小。可能是因为在一定的温度范围内，反应温度越高，反应物的活性就会越强，TFP 乙酰基的取代度就随之增大，但当温度超过60 ℃时，由于乙酸酐的水解速度过快，进而导致TFP 乙酰基的取代度相应减小。

图3 反应温度对TFP 乙酰基取代度的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on substitution degree of Ac-TFP

2.2 TFP乙酰化工艺条件优化

2.2.1 响应模型的建立

在单因素试验结果的基础上，以乙酰基取代度为指标，设计以反应时间（A）、反应温度（B）和乙酸酐用量（C）三因素的回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，试验因素和水平设计见表1，响应面试验设计方案及结果见表2，响应面分析得出的回归模型参数方差分析见表3。

表1 响应面试验因素与水平设计表Table 1 Factors and levels designed for response surface analysis

表2 响应面试验结果Table 2 Experimental results for response surface analysis

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial mode

利用Design-Expert 软件对表2 中的试验结果进行二次方程拟合，得到TFP 对反应时间（A）、反应温度（B）和乙酸酐用量（C）与乙酰基取代度（Y）之间的二次多项回归方程的模型为：

Y=0.43-0.089A-0.001B-0.018C-0.006 75AB-0.015AC-0.038BC-0.093A2-0.048B2-0.06C2

表3 中的数据显示，F 值为 44.96，P＜0.000 1，结果为二次多项回归方差的模型极显著，失拟误差的P 值为0.095 6，大于0.05，结果为不显著，则表明建模成功。拟合得到的二次多项回归方程系数R2=0.983 0，证明建模可信度较高。

表3 的方差分析结果中还可看出，试验组合中的各因素中，A 和C 的P 值都小于0.05，即反应时间和乙酸酐用量对Ac-TFP 乙酰基取代度的影响显著，并且时间因素的影响最为显著，3 个因素对Ac-TFP 乙酰基取代度的影响大小为：反应时间（A）＞乙酸酐用量（C）＞反应温度（B）。

2.2.2 TFP 乙酰化修饰响应面分析

反应时间和反应温度对TFP 乙酰基取代度的影响效果见图4。

由图4 可知，相较于反应温度，反应时间的影响更显著，曲线更陡，等高线更密集。反应时间和乙酸酐用量对TFP 乙酰基取代度的影响效果见图5。

由图5 可知，相较于乙酸酐用量，反应时间对TFP乙酰基取代度的影响效果更为显著，曲线更陡，等高线更密集。反应温度和乙酸酐用量对TFP 乙酰基取代度的影响效果见图6。

图4 反应时间和反应温度对取代度的影响Fig.4 Effects of reaction time and reaction temperature on substitution degree of Ac-TFP

图5 反应时间和乙酸酐用量对取代度的影响Fig.5 Effects of reaction time and acetic anhydride amount on substitution degree of Ac-TFP

图6 反应温度和乙酸酐用量对取代度的影响Fig.6 Effects of reaction temperature and acetic anhydride amount on substitution degree of Ac-TFP

结果显示为反应温度和乙酸酐用量相比较而言，对TFP 乙酰基取代度的影响相差不大，交互影响较为显著，从曲线陡的程度看来，乙酸酐用量对TFP 乙酰化修饰的影响程度要大于反应温度对TFP 乙酰化修饰的影响程度。

2.2.3 TFP 乙酰化修饰最佳工艺条件确定及验证

利用Design-Expert 8.06 软件对响应面试验结果进行分析，可预测得到TFP 乙酰化修饰最佳工艺条件为：反应温度61.04 ℃，反应2.37 h，添加的乙酸酐用量2.89 mL，在该条件下，乙酰化银耳多糖取代度为0.39。按照此预测条件进行验证试验，为使试验更具有可行性，调整预测工艺条件为：反应时间2.4 h，反应温度61 ℃以及乙酸酐用量为2.9 mL。重复试验3 次，得到的DS 值为0.385，与预测值差异很小，证明建立的模型可靠。

2.3 Ac-TFP的结构表征分析

TFP 和Ac-TFP 的红外光谱图见图7。

图7 TFP 和Ac-TFP 的红外光谱图Fig.7 Infrared spectra of TFP and Ac-TFP

TFP 和Ac-TFP 的特征峰与对应的波长和基团振动情况见表4。

表4 TFP 和Ac-TFP 特征峰对应的波长和基团振动情况Table 4 Wave numbers and peaks belong to the Fourier transform infrared（FTIR）spectra of TFP and Ac-TFP

3 416 cm-1左右为糖分子内或分子间氢键O-H 伸缩振动峰，2 932cm-1左右为次甲基（-CH2-）中的 C-H 的伸缩振动的吸收峰[16]。修饰后Ac-TFP 在1 727.19 cm-1处出现的吸收峰为酯基C＝O 双键的收缩振动，同时在1 255.27 cm-1处有一个较弱的酯基C-O 的收缩振动[17]，说明乙酰化衍生物中已经成功加入了乙酰基。

2.4 Ac-TFP的抗氧化活性

2.4.1 Ac-TFP 对·OH 清除作用

TFP 和 Ac-TFP 对·OH 的清除作用见图8。

图8 TFP 和 Ac-TFP 对·OH 的清除作用Fig.8 Scavenging capacity of TFP and Ac-TFP on hydroxyl free radicals

从图中8 可以看出，TFP 对·OH 具有较为良好的清除效果。在多糖质量浓度为0.2 mg/mL～1.0 mg/mL时，TFP 和 Ac-TFP 对·OH 的清除能力逐渐变强，尤其是在0.8 mg/mL 后，两者对·OH 的清除效果增强的最为明显。且TFP 对·OH 的清除作用明显高于Ac-TFP对·OH 的清除作用，在多糖质量浓度为1.0 mg/mL 时，TFP 对·OH 的清除率达到 77.52%，而 Ac-TFP 对·OH的清除率为60.11%。一般来说，化学基团的引入可能会增强多糖的活性，或使多糖产生新的活性，但同时也可能使某些活性降低或者消失。与TFP 相比，Ac-TFP 对·OH 的清除作用有所减弱，可能与乙酰基引入的位置等有关，抑制了多糖的生物活性的发挥，从而降低了对·OH 的清除作用。

2.4.2 Ac-TFP 对DPPH 自由基的清除作用

TFP 和Ac-TFP 对DPPH 自由基的清除作用见图9。

图9 TFP 和Ac-TFP 对DPPH 的清除作用Fig.9 Scavenging capacity of TFP and Ac-TFP on DPPH free radicals

从图9 可以看出，在一定的多糖质量浓度范围内，TFP 和Ac-TFP 对DPPH 自由基的清除效果都随着多糖质量浓度的升高而增强，与TFP 相比，Ac-TFP 对DPPH 自由基的清除作用增强，这可能是因为乙酰化修饰使得银耳多糖分子间的构象发生了改变，乙酰基的引入增加了多糖分子的溶解性，更易于发挥生物活性作用，使其对DPPH 自由基的清除效果得到了相应的增强。王之珺等[18]研究了乙酰化青钱柳多糖对DPPH自由基的清除能力，发现乙酰化修饰后的青钱柳多糖对DPPH 自由基的清除能力明显增强。

2.4.3 Ac-TFP 对 O2-·的清除作用

TFP 和 Ac-TFP 对 O2-·的清除作用见图10。

图10 TFP 和 Ac-TFP 对 O2-·的清除作用Fig.10 Scavenging capacity of TFP and Ac-TFP on superoxide anion free radicals

从图10 可以看出，在一定质量浓度范围内，TFP和Ac-TFP 对O2-·自由基均有一定的清除作用，且随着多糖质量浓度的升高而增强，且增强的幅度在逐渐增大，但Ac-TFP 的清除作用弱于TFP，表明对TFP 进行乙酰化修饰后会减弱其对O2-·自由基的清除能力。

3 结论

该文以TFP 为原料，使用乙酸酐法对TFP 进行乙酰化修饰，以取代度为指标，利用响应面优化分析确定了TFP 乙酰化修饰的最佳工艺条件为：反应时间2.37 h，反应温度为61.04 ℃，乙酸酐用量为2.89 mL，在此工艺条件下，乙酰基取代度为0.39。抗氧化活性结果表明，TFP 和 Ac-TFP 对·OH、DPPH 自由基和 O2-·均有一定的清除能力，且清除能力随多糖质量浓度的升高而增大。与TFP 相比，Ac-TFP 对DPPH 自由基的清除能力有所增强，而对·OH 和O2-·清除能力减弱。