猪源杀鲑气单胞菌分离鉴定及毒力因子检测

邓同炜,蒋增海,,霍元楠,宋 浩,何启盖

(1.河南牧业经济学院动物医学院,河南 郑州450046;2.河南省猪病防控工程技术研究中心,河南 郑州450046;3.华中农业大学 农业微生物国家重点实验室,湖北 武汉430070)

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida),是一种最早被认识的鱼类病原菌,广泛分布于淡水与海水中,除了作为人们最为熟知的鲑鱼病原菌外,还可感染其他许多鱼类品种,该菌分为5 个亚种,分别为杀鲑亚种(A.salmonicida subsp.salmonicida)、无色亚种(A.salmonicida subsp.achromogenes)、杀日本鲑亚种(A.salmonicida subsp.masoucida)、杀田唇乌蝇翼亚种(A.salmonicida subsp.smithia)和彭氏亚种(A.salmonicida subsp.Pectinolytica)[1]。Varshney A首次报道了1 例白内障病人手术后2 周感染眼内膜炎,是由杀鲑气单胞菌导致[2]。Fontes 报道从屠宰场采集猪胴体、膈肌、脱毛器、粪便和水等样品中,分离气单胞菌,最后分离到嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌等9 个品种的气单胞菌[3]。

2016 年10 月,河南漯河某养猪场存栏保育仔猪50 多头,于2 周前,猪群的蹄部、口腔出现水疱,疑似口蹄疫感染,自愈后,又开始发病,临床症状表现为咳嗽、喘气、体温升高等,死亡3 头,送检1 头典型症状死亡的病例,剖检病变为肺脏充血、出血性病灶,脾脏淤血、边缘有梗死。养殖户反映,病初时怀疑为呼吸道病感染,使用强力霉素、阿莫西林或磺胺类药物等拌料治疗,无效,然后送检本室诊断。通过临床症状和病理剖检,怀疑为细菌感染,通过无菌采集病料,首次从发病猪体内分离到一株杀鲑气单胞菌。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 绵羊鲜血琼脂平板,购自郑州博赛生物有限公司;营养肉汤、普通营养琼脂,购自北京奥博星生物技术有限责任公司;2×Taq PCR Master Mix,购自南京诺唯赞生物科技有限公司;DL-2 000 DNA Marker、琼脂糖和核酸染料,购自宝生物工程(大连)有限公司;生化试管,购自青岛海博生物技术有限公司;MH 琼脂、药敏纸片,购自英国Oxoid 公司;大肠杆菌(ATCC25922)为质控菌,由扬州大学人兽共患病学江苏省重点实验室惠赠。体重为20 g~25 g 健康昆明系小鼠由本校动物房提供。

1.2 细菌分离培养与染色镜检 无菌采集发病猪的肺、肝脏和脾脏,75%酒精棉球擦拭病料,并引火自燃,除去表面杂菌,同时火焰燃烧消毒剪刀、镊子,剪去外表面的组织,取深部组织,接种血琼脂平板,37 ℃恒温培养24 h,挑取形状、大小和颜色一致的优势菌落,进一步接种血琼脂平板,纯化2~3 代。同时,挑取纯化后的单菌落涂于载玻片,以无菌生理盐水混匀,自然干燥,火焰上加热固定,通过革兰染色后显微镜下观察。

1.3 分离菌的16S rDNA 分子鉴定 水煮沸法提取分离菌株的DNA 模板,参照文献[4],合成通用引物 (16S-27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,16S-1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′),利用PCR 技术扩增16S rDNA 片段,预期扩增大小约1 500 bp,扩增结果送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序16S rDNA 结果 在NCBI GenBank 数据库中进行BLASTn 比对,鉴定菌种。

1.4 分离菌的生化试验 使用细菌微量生化反应管,按生产厂家说明书要求的条件培养,并在规定的时间内观察结果,参照文献[5]进行结果判定。

1.5 分离菌的小鼠致病性试验 将分离纯化菌株,接种于营养肉汤中,37 ℃恒温条件下,过夜培养,然后将其稀释为5×108CFU/mL 菌液,采取灌胃接种,每只小鼠接种0.2 mL,共接种4 只。同样,选择4只小鼠作为对照组,每只小鼠接种无菌营养肉汤0.2 mL。观察2 周,记录小鼠的临床表现。

1.6 分离菌的药敏试验 以大肠杆菌(ATCC-25922)为质控菌株,按照世界卫生组织(WHO)推荐的K-B 和参照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)手册方法[6],对分离菌株进行药敏试验,其结果按照上述手册进行判读。

1.7 分离菌的毒力基因检测 水煮沸提取细菌DNA 模板,参照文献[7],合成6 对引物(见表1),利用PCR 技术扩增分离菌株的毒力基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 扩增不同毒力基因引物序列

2 结果与讨论

2.1 细菌分离培养与染色镜检结果 无菌采集肺脏、肝脏和脾脏,分别接种于血琼脂平板,37 ℃恒温培养24 h 后,均能生长成一种乳白色、湿润、半透明、β 溶血、大小为2 mm~3 mm 的中心凸起呈圆锥形的优势菌落。革兰染色为一种革兰阴性杆菌,无芽孢和荚膜(见中插彩版图1)。

图1 分离菌株为革兰阴性杆菌

2.2 分离菌的16S rDNA 分子鉴定 该分离菌株的16S rDNA 片段PCR 扩增后,电泳检测显示获得约1 500 bp 目的条带(图略)。扩增产物测序比对分析后,其结果显示分离菌株与NCBI GenBank 数据库中杀鲑气单胞菌杀鲑亚种YZ-1 株的同源性最高,为99%。因此,将分离菌株鉴定为杀鲑气单菌杀鲑亚种。

2.3 分离菌的生理生化特征 生化试验结果显示,氧化酶试验为阳性,吲哚试验、V-P 试验阴性,甲基红阳性,H2S 和脲酶试验为阴性,苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶为阴性,精氨酸双水解酶为阳性,D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、麦芽糖、D-甘露醇、海藻糖、ONPG 为阳性,丙二酸利用盐、乳糖、纤维二糖、棉籽糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-山梨醇为阴性。分离菌株符合杀鲑气单胞菌特征。

2.4 分离菌的小鼠致病性试验 4 只小鼠攻毒接种以后,第3 天,均开始发病,表现为精神不振,倦怠,不愿走动,怕冷,第4 天死亡1 只,剩下3 只小鼠,2 周后康复;4 只对照小鼠均正常。本试验表明分离菌株对小鼠具有一定致病性。

2.5 分离菌的药敏试验 药敏试验结果表明,该分离菌对磺胺异噁唑、四环素、土霉素、阿莫西林/克拉维酸、卡那霉素、氨苄西林、头孢唑啉、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶耐药;对庆大霉素、阿米卡星、头孢噻呋、恩诺沙星、环丙沙星等敏感;对氯霉素中介(表2)。从药敏试验结果来看,该分离菌株耐药性严重,多种药物均不能作为治疗用药,应该根据药敏试验结果,选择敏感的药物如头孢噻呋、庆大霉素或者恩诺沙星进行治疗。

表2 药敏试验结果

2.6 分离菌的毒力基因检测 该分离菌株毒力基因PCR 检测结果显示,6 个被检测毒力基因中act、ast、fla、lipase 检测为阳性,alt、elastase 检测为阴性(图2),表明该分离菌株可能具有致病性。

图2 毒力因子PCR 检测结果

3 讨论

针对人类,基于感染频次,气单胞菌临床感染分为四大类:1.胃肠道综合征;2.外伤和软组织感染;3.菌血症感染,例如免疫低下败血症感染;4.其他方面各种各样的很少发生的感染[5]。因此,免疫力低下人群,容易患气单胞菌的肠道外感染。本研究首次从疑似口蹄疫自愈后的病死仔猪体内,分离到1 株杀鲑气单胞菌,表明猪群在感染口蹄疫后,造成免疫力下降,存在感染杀鲑气单胞菌的风险。

本研究药敏试验结果,表明该猪源杀鲑气单胞菌分离菌株对兽医临床常用药物如磺胺类药物、四环素类药物、β-内酰胺类抗生素均耐药,是导致养殖户在送检前进行治疗失败的原因。据笔者调查,当前养猪户十分喜爱使用磺胺类药物、强力霉素、阿莫西林或者氟苯尼考等粉剂拌料,用于预防或者治疗猪病,可能是导致猪场病菌对这些药物产生广泛耐药的基础,应该引起注意;当遇到治疗细菌性猪病失败时,必须结合药敏试验结果,选择敏感性药物进行治疗,减少损失。

由于杀鲑气单胞菌属于鱼类病原,以前没有该菌感染猪群的报道,本次猪群杀鲑气单胞菌属首例,属于跨种传播感染。那么杀鲑气单胞菌是从何处来的呢?是从环境中而来,还是从饲料中水产品携带而来呢?本次病例属于偶然情况,还是具有普遍意义?有待于进一步调查研究。