补中益气汤发酵制剂对肉鸡肠道环境和黏膜结构的影响

靳双星,张桂枝,王学强,张 潇

(1.河南牧业经济学院动物医学院,河南 郑州450046;2.河南牧业经济学院动物科技学院,河南 郑州450046;3.开封市动物疫病预防控制中心,河南 开封475000)

近年来,通过微生物发酵手段炮制中药的研究越来越受到重视,并取得了一定进展[1-4],发酵过程可以改变中药的原始生物活性物质和营养成分,经过微生物发酵处理后的中药富含维生素、酶和生长因子[5-6]。发酵中药与未发酵中药相比,可较大幅度地改变药性,提高疗效,降低毒副作用,扩大适应症,已成为中药研究与开发的热点[7]。现代药理研究显示,补中益气汤具有调整胃肠运动,调节胃酸与胃蛋白酶分泌,增强小肠对葡萄糖吸收,增加胰液分泌等功效[8-10]。因此,本课题组根据中兽医理论及养殖生产实践研制出补中益气汤发酵制剂。为探讨其对肉鸡肠道环境和黏膜结构的影响,在饲料中添加不同剂量的补中益气汤发酵制剂,测定肠道主要菌群数量、酶活性、pH 值及黏膜结构等指标的变化,为该制剂在生产实践中应用提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验样品 补中益气汤是由黄芪、党参、白术、当归、柴胡、升麻、陈皮、甘草等8 味中药组成的。发酵方法参考张桂枝的文献[11]。

1.2 试验设计 1 日龄健康AA 肉鸡,隔离饲养至7 日龄,选取300 只体重相近健康的肉仔鸡,随机分为4 组,每组设置5 个重复,每个重复15 只肉鸡,自由采食和饮水,分笼饲养,试验期间各组饲养管理条件完全一致。 空白对照组饲喂基础日粮,中药对照组在基础日粮中按质量分数添加1%未发酵补中益气汤中药,试验1、2 组在基础日粮中按质量分数分别添加0.5%、1%补中益气汤发酵制剂,混饲,连续添加。各组肉鸡均在7 日龄1.5 倍量点眼滴鼻免疫接种新城疫活疫苗(LaSota株);21 日龄2.5 倍量饮水免疫接种新城疫活疫苗(LaSota 株)。

1.3 主要试剂 淀粉酶检测试剂盒、蛋白酶检测试剂盒、脂肪酶检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所);新城疫活疫苗(LaSota 株)(购自齐鲁动物保健品有限公司)。

1.4 主要仪器 生化培养箱、CO2培养箱、恒温培养箱、酶标仪、奥林巴斯生物显微镜、pHS-3B 型酸度计、离心机、无菌操作台、微型振荡器、微量移液枪、高压蒸汽灭菌锅等。

1.5 检测指标及测定方法

1.5.1 肠道菌群数量的测定 在21、35 日龄时,每组随机选取6 只健康肉鸡,屠宰后,立即剖开腹部并截取回肠、盲肠各4 cm 左右,两端用细绳结扎,用75%酒精消毒接扎口,装进灭菌袋子里,-20 ℃冰箱保存。检测时取待测肠段食糜,在超净工作台上称取0.5 g 肠道食糜,放进提前灭菌过的试管内,加入灭菌生理盐水4.5 mL 后,振荡5 min,用灭菌纱布过滤,取0.5 mL 上清加入第二个试管中,按照上述步骤重复进行10 倍稀释,然后取104~106倍稀释液各50 μL 接种在麦康凯和LBS 培养基上,麦康凯培养基37 ℃生化培养箱培养24 h,LBS 培养基37 ℃CO2培养箱培养48 h,计数,求出每克食糜所含的细菌数,单位用(CFU/g)表示。

1.5.2 肠道酶活性的测定 在21 日龄和35 日龄,每组抽取6 只正常肉鸡,屠宰后立刻取十二指肠、空肠和盲肠内容物4 g,迅速搅拌均匀,放入离心管置于-20 ℃的冰箱中保存。测定前,将样品在冰上解冻,进行10 倍稀释,混匀后放置在离心机3 500 r/min 离心10 min,取上清液,按试剂盒说明书测定脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶酶活性。

1.5.3 肠道pH 值的测定 在21、35 日龄,每组抽取6 只正常肉鸡,屠宰后,迅速打开腹腔,取出十二指肠、空肠、回肠、盲肠的内容物各1 g 放置在离心管内,按照1 ∶8 的比例加入超纯水(调节pH值7.0),振荡混匀,用酸度计测pH 值。

1.5.4 肠道组织结构指标测定 分别在21、35 日龄时,每组随机抽取6 只健康肉鸡,屠宰后,打开腹腔,截取卵黄蒂后1 cm 位置回肠肠管3~4 cm,用装有生理盐水的注射器在不损坏肠绒毛结构的前提下,冲去肠道内容物,然后将肠道两端结扎,并注入适量的10%甲醛磷酸缓冲液,然后放入缓冲液中固定4~6 h 后,剪去结扎的两端,制作组织切片,观察肉鸡的肠道组织结构。选取测定样本最厚肠壁厚度、最深隐窝深度和最长绒毛长度。

1.6 统计分析 试验数据采用SPSS 20.0 统计软件进行单因素方差分析,并用Duncan′s 法检验显著性,以P<0.05 作为是否有差异显著性的判断标准;试验数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 补中益气汤发酵制剂对肉鸡肠道菌群数量的影响 由表1 可知,回肠与盲肠乳酸杆菌数量均有不同程度增加。试验1、2 组回肠乳酸杆菌数量与空白对照组相比差异显著(P<0.05),试验2 组21 日龄及试验1 组35 日龄盲肠乳酸杆菌数量与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。中药对照组与空白对照组相比,乳酸杆菌数量没有明显差异(P>0.05);而在35 日龄回肠、盲肠乳酸杆菌数量与试验1 组相比差异明显(P<0.05),中药对照组回肠乳酸杆菌数量与试验2 组相比差异显著(P<0.05)。在肉鸡日粮中添加入不同剂量发酵中药,大肠杆菌数量均有不同程度减少。21 日龄时,试验2 组回肠与试验1 组盲肠大肠杆菌数量与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。35 日龄时,试验1、2 组回肠、盲肠中大肠杆菌数量与空白对照组相比明显减少(P<0.05)。中药对照组不同日龄回肠、盲肠大肠杆菌数量与空白对照组及试验1、2 组相比,没有明显的差异(P>0.05)。

2.2 补中益气汤发酵制剂对肉鸡肠道酶活性的影响 由表2 可知,在21 和35 日龄时,试验1、2 组与空白对照组相比,淀粉酶和蛋白酶活性明显升高(P<0.05),在21 日龄,试验1 组淀粉酶活性明显高于中药对照组(P<0.05),中药对照组淀粉酶活性明显高于空白对照组(P<0.05)。35 日龄时,中药对照组蛋白酶活性明显高于空白对照组(P<0.05),与试验1、2 组相比,淀粉酶与蛋白酶活性有显著性差异(P<0.05)。

表1 补中益气汤发酵制剂对肉鸡肠道菌群数量的影响 (CFU/g)

表2 日粮中添加复方中药混菌发酵制剂对肉鸡肠道酶活性的影响 (U/g)

2.3 补中益气汤发酵制剂对肉鸡肠道pH 值的影响 由表3 可知,肉鸡肠道pH 值各组均有不同程度的下降,十二指肠的pH 值下降不显著,各组间无显著差异(P>0.05)。 在21 日龄时,试验2 组的空肠、回肠、盲肠pH 值下降最为明显,与空白对照组相比差异显著(P<0.05);在35日龄时,与空白对照组相比,试验组1、2 组空肠、回肠、盲肠pH 值明显降低(P<0.05),而中药对照组只有回肠pH 值与空白对照组差异显著(P<0.05)。

表3 日粮中添加复方中药混菌发酵制剂对肉鸡肠道pH 值的影响

2.4 补中益气汤发酵制剂对肉鸡肠道组织结构的影响 从封二彩版图1、图2 可以看出,试验1组和试验2 组肠绒毛明显变长,绒毛排列整齐、光滑,形态一致,单位面积上肠绒毛数量较多,而空白对照组和中药对照组肠绒毛较宽,短而粗糙。

图1 21 日龄肉鸡回肠组织切片

图2 35 日龄肉鸡回肠组织切片

由表4 可知,21 日龄时,与空白对照组及中药对照组相比较,试验1、2 组的肠绒毛长度显著变长,隐窝深度变浅,肠壁厚度变薄(P<0.05);中药对照组与空白对照组相比较没有明显差异(P>0.05)。35 日龄时,与空白对照组及中药对照组相比较,试验1 的肠绒毛长度显著增加,隐窝深度、肠壁厚度显著降低(P<0.05);而试验2 组只有肠绒毛长度差异显著(P<0.05)。

表4 日粮中添加复方中药混菌发酵制剂对肉鸡肠道组织结构的影响 (μm)

3 讨论

3.1 补中益气汤发酵制剂对肉鸡肠道菌群数量的影响 肠道微生物菌群是消化系统的一个重要组成部分,乳酸杆菌和大肠杆菌常被作为研究畜禽肠道菌群的主要代表菌,其活菌含量与畜禽的健康密切相关[12]。董秀梅等研究表明,复方微生态制剂能使肠道中乳酸杆菌的数目明显增多,并能明显降低肠道内大肠杆菌的数目[13]。李树鹏等研究表明,益生菌和黄芪多糖均能使肠道中的有益菌增殖,并阻抑有害菌的生长,两者同时添加,作用增强[14]。本试验结果表明,在日粮中添加补中益气汤发酵制剂,回肠、盲肠乳酸杆菌的数目显著增加,而大肠杆菌的数目明显下降。而未发酵的补中益气汤制剂虽有一定的促进乳酸杆菌增殖,抑制大肠杆菌繁殖的作用,但没有发酵制剂明显。因此,在日粮中添加一定剂量的补中益气汤发酵制剂能够调整肉鸡肠道菌群,促进有益菌的增殖,抑制有害菌繁殖。

3.2 补中益气汤发酵制剂对肉鸡肠道酶活性的影响 肠道消化酶来源于肠道微生物、机体分泌及外界摄入,是生物机体肠道内重要组成部分,参与肠道许多重要生物化学过程和物质循环,在机体营养物质消化吸收、免疫和生长发育等方面具有重要作用[15]。张利娟等研究发现,黄芪多糖和小檗碱的复合制剂能提高鸡肠道淀粉酶和蛋白酶的活性[16]。王国霞等在虾日粮中添加嗜酸性乳酸杆菌,发现能够使虾肠道内淀粉酶和蛋白酶的活性明显增高[17]。Jin 等试验表明,饲喂乳酸菌对肉鸡小肠黏膜脂肪酶活性没有明显影响,能使淀粉酶的活性明显增高[18]。但王志祥等在仔猪饲料里加入了乳酸杆菌,屠宰后仔猪十二指肠和胰腺内脂肪酶和淀粉酶的活性明显的提高[19]。张晓梅等在雏鸡日粮中添加地衣芽孢杆菌和乳酸杆菌等混菌发酵,结果发现能明显提高雏鸡肠道内脂肪酶和蛋白酶的活性[20]。前人研究发酵中药对动物消化酶活性影响还鲜有报道。本试验研究结果表明,日粮中添加补中益气汤发酵制剂可以显著提高肠道淀粉酶和蛋白酶活性,而对脂肪酶活性影响不明显。未发酵补中益气汤制剂也有相似的作用。说明补中益气汤发酵制剂对促进动物胃肠道兴奋和消化腺分泌消化酶及提高饲料利用率等具有重要作用。这可能与补中益气汤发酵制剂能有效地促进小肠绒毛发育,增加消化吸收面积;调节肠道pH 值,为某些消化酶提供适宜的生化反应条件;调节肠道菌群,使肠道外源酶增加、促进内源酶分泌及酶基因表达水平增强等原因有关,从而使肠道酶活性提高。

3.3 补中益气汤发酵制剂对肉鸡肠道pH 值的影响 肠道pH 值在动物对饲料养分消化、吸收和利用的过程中起着极其重要的作用,pH 值稳定是保证动物肠道各类消化酶完成生物催化,维持消化道菌群动态平衡的一个重要因素[21]。 目前,添加物对畜禽肠道pH 值影响的研究上主要集中在微生态制剂和酸化剂上,多数研究表明,添加物可显著降低肠道pH 值[22-23];中药对肠道pH值的影响研究较少,多没有明显作用效果[21,24];关于发酵中药对肠道pH 值的影响还鲜有报道。本试验结果表明,补中益气汤发酵制剂能使肉鸡空肠、回肠和盲肠pH 值显著下降。肠道环境酸化,提高肠道酶活性,有利于日粮中营养物质的消化吸收,有利于有益菌群的繁殖。

3.4 补中益气汤发酵制剂对肉鸡肠道组织结构的影响 动物小肠黏膜绒毛高度、隐窝深度和肠壁厚度是评判肠道消化能力的重要指标[25]。张金龙等研究结果表明,在饲料中添加2%发酵桑叶粉可显著提升肉鸡肠绒毛高度,增加了肠道隐窝深度[26]。邢亚丽等研究表明,在日粮中添加0.1%和0.2%树舌发酵浸膏多糖可显著增加肉鸡肠绒毛高度,降低隐窝深度,提高肠绒毛高度和隐窝深度的比值[27]。本试验结果表明,补中益气汤发酵制剂可显著地增加肉鸡肠绒毛长度,降低隐窝深度和肠壁厚度。说明补中益气汤发酵制剂可明显促进小肠黏膜绒毛的生长发育,改善消化道黏膜形态与结构,进而增加肉鸡消化吸收能力。

4 结论

在肉鸡饲料中添加补中益气汤发酵制剂,能调节肠道菌群组成,增加肠道内源酶活性,调节肠道pH 值,改善肠道形态结构。