HPLC法测定知柏地黄丸中毛蕊花糖苷的含量

李腾 汤莹*

（华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，湖北 武汉 430030）

知柏地黄丸系中药成方制剂，由熟地黄、知母、黄柏、山茱萸（制）、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻8味中药组成，具有滋阴清热的功效。用于阴虚火旺，潮热盗汗，口干咽痛，耳鸣遗精，小便短赤。该制剂选药精当，力有所专，补泄均衡，配伍严谨，临床应用广泛，疗效确切。制剂质量标准执行《中华人民共和国药典》（2015版）标准，标准中除常规检查和理化鉴别外，对制剂中的马钱苷（来源于山茱萸）和丹皮酚（来源于牡丹皮）含量设定了质控限值。制剂中熟地黄是方中主药，具有补血滋阴，益精填髓等功效，指标成分为毛蕊花糖苷，临床上应用较为广泛，用于血虚萎黄、心悸怔忡、月经不调、崩漏下血、肝肾阴虚、腰膝酸软、骨蒸潮热、盗汗遗精、内热消渴、眩晕耳鸣、须发早白等［1-4］。我们查阅文献了解到，目前虽有知柏地黄丸临床疗效及质量控制相关的研究报道［5-6］，但尚未有对毛蕊花糖苷进行含量限值控制的相关研究报道。为了进一步完善知柏地黄丸的质量标准［7］，本文建立了HPLC法测定知柏地黄丸的毛蕊花糖苷含量的方法，方法简便快速、准确度高、专属性强，可用于知柏地黄丸中毛蕊花糖苷的测定，为提高知柏地黄丸质量标准提供借鉴。

1 材料

1.1 仪器 安捷伦1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；超声波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司）；赛多利斯BP211D电子分析天平（德国赛多利斯股份公司）；RC806型溶出试验仪（天津市天大天发科技有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）

1.2 药品与试剂 毛蕊花糖苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111530-201713）；知柏地黄丸（北京某厂（批号：180826、180908、180919）；知母、黄柏、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓和泽泻药材（均购自安徽天马中药饮片科技有限公司）；乙腈，甲醇为色谱纯（美国Merck公司）；其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相：乙腈-0.1% 乙酸溶液（13∶87，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：334 nm；柱温：33℃；进样量：10 μL［8-10］。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品2.08 mg，用流动相为溶剂制成10 mL的毛蕊花糖苷溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研碎，过6号筛，取约1 g，精密称定，置于棕色容量瓶中，精密加入50% 甲醇50 mL，称定质量，浸泡30 min，超声（功率：50 W，频率：40 kHz）处理30 min，放至室温，再称定质量，用50%甲醇补足差重，摇匀，过滤，精密吸取25 mL续滤液，置于恒温水浴锅60℃下挥干，残渣加流动相定容至5 mL，过0.45 μm滤膜，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取处方中除熟地黄外的其余药味，按知柏地黄丸的制法制备不含熟地黄的阴性对照制剂，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 阴性干扰试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱，见图1。由图1可见，毛蕊花糖苷峰相应的位置未见其他的干扰峰出现。

图1 高效液相色谱图

2.4 线性关系考察 精密称取毛蕊花糖苷对照品适量，精密吸取上述对照品溶液 （208 μg/mL）0.25、0.5、1、2.5、5 mL置于10 mL的容量瓶中，用流动相定容至刻度线，加上母液共配制成6个浓度对照品溶液，进样量均为10 μL，以进样浓度（mg/mL）为横坐标，峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，计算的线性方程为y=226.13×x-1.0111，r=0.9998。结果表明，毛蕊花糖苷在5.2×10-3～208×10-3mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按照“2.1”项下的色谱条件重复进样6次，测定峰面积。结果，毛蕊花糖苷峰面积的RSD＝0.92%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：180826） 适量，分别于放置0、4、8、12、20、24 h时精密吸取10 μL，注入HPLC仪，按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积。结果，毛蕊花糖苷峰面积的RSD＝1.18%，表明供试品溶液在24 h内质量稳定。

2.7 重复性试验 取样品（批号：180826）适量，共6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定毛蕊花糖苷的峰面积并计算含量。结果，毛蕊花糖苷含量的RSD＝1.37%，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（0.906 6 mg/g）约1.0 g，分别精密加入低、中、高不同量的对照品六份，编号，然后按上述方法，最后稀释至25 mL，制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件测定含量，计算回收率，结果平均回收率为97.4%，RSD=1.28%，表明本方法可靠，见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.9 样品含量测定 分别取知柏地黄丸3批各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，计算含量。结果3批样品中毛蕊花糖苷平均含量分别为0.25、0.28、0.26 mg/丸。以80%的转移率计，制剂中毛蕊花糖苷不应少于0.21 mg/丸。

3 讨论

3.1 提取方法的选择 本实验预实验时比较了纯水、50%乙醇和75%乙醇三种提取溶剂，结果表明三种溶剂均能将毛蕊花糖苷提取完全，结合干膏得率和经济效益，最终采用50%乙醇做提取溶剂。比较了25、50，75，100倍提取溶剂的提取效率，结果表明50倍，75倍和100倍取溶剂的提取效率没有显著性差异，最终采用50倍提取容积提取。同时考察了超声波提取时间，最终确定超声波提取30 min。因此最终确定提取方法为：用50倍50%乙醇，超声波提取30 min。采用本法提取知柏地黄丸中的毛蕊花糖苷，准确可靠。

3.2 流动相的选择 本实验同期曾采用乙腈∶纯水、甲醇∶纯水和甲醇∶0.1%乙酸溶液作为流动相，同时考察了不同比例对色谱的影响，但实验结果显示要么杂质峰过多而目标峰不明显，要么峰形拖尾均严重。经过对比，结果表明采用乙腈-0.1% 乙酸溶液 （13∶87，V/V） 作为流动相，样品峰型最为稳定，杂质峰较少，保留时间适宜，灵敏度高，可为相关制剂中毛蕊花糖苷的含量测定提供一种新方法。

3.3 本研究的价值 中药制剂质量标准中的含量测定项首选君药，熟地黄为知柏地黄丸方中君药，其指标成分毛蕊花糖苷，应当设立毛蕊花糖苷为标准中含量测定项，参考本实验结果，建议知柏地黄丸中熟地黄含量以毛蕊花糖苷计不应少于0.21 mg/丸。本实验方法可快速测量知柏地黄丸中毛蕊花糖苷的含量，方法简便、结果准确、灵敏度高、重复性好，可为进一步提高知柏地黄丸的质量控制提供借鉴，同时可也为其他中成药制剂中熟地黄的质量控制提供参考。