利用蜗牛消化酶获得植物原生质体*

杨 令 曹祥华

（1 北京师范大学芜湖附属学校 安徽芜湖 241080 2 怀宁县高河中学 安徽怀宁 246121）

植物原生质体是除去细胞壁后被原生质所包围的“裸露细胞”。植物细胞被细胞壁包裹时呈不规则形态；去除细胞壁后，呈圆球形。原生质体是开展基础研究的理想材料，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。原生质体融合是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可避免传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中。原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一［1］。

获取植物原生质体的方法有机械法和酶解法。其中酶解法是一种常用的技术，其原理是，植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁［1］，而得到植物原生质体。为了保持无细胞壁的原生质体的活力和膜稳定性，酶液的渗透压必须与处理的细胞的渗透压相近。

1 创新背景

人教版高中生物学选修3 教材中提及通过酶解法获取植物原生质体。高中阶段涉及有关酶的实验，往往采用的都是活性材料，笔者尝试从活体蜗牛中提取蜗牛酶制备植物原生质体，有助于学生直观地观察和研究原生质体。

蜗牛是一种植食性动物。蜗牛酶是从蜗牛消化道里提取出来的一种混合酶系，包含纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20 多种混合酶。为了获取蜗牛的消化酶，可对蜗牛进行活体解剖，摘取嗉囊和消化道，收集消化液。然后对植物细胞进行处理，降解其细胞壁获得原生质体。

综上所述，本研究主要包括2 个实验，即蜗牛的活体解剖实验和原生质体的制备与观察。

2 材料与方法

2.1 实验材料 菠菜或其他蔬菜的幼叶、白玉蜗牛消化道和嗉囊。

2.2 实验试剂 配制13%细胞-原生质体清洗液（CPW 洗液）：2×10-4mol／L KH2PO4、1×10-3mol／L KNO3、1×10-2mol／L CaCl2、2.05×10-3mol／L MgSO4、1×10-6mol／L KI、1.5×10-8mol／L CuSO4、13% W／V甘露醇pH=6.0。

其中，13%甘露醇使植物细胞质壁分离，有助于酶解细胞壁；钙离子能稳定细胞膜的活性。CPW洗液冲洗蜗牛消化道，获取溶解有消化酶的混合液［2］。混合液处理叶肉细胞后，可洗脱原生质体，维持渗透压保持原生质体的正常形态。

2.3 实验器材 显微镜、载玻片、盖玻片、注射器、镊子等。

2.4 实验步骤

2.4.1 蜗牛的活体解剖

1）实验材料的预处理。从花鸟宠物市场购买白玉蜗牛若干，饥饿2～3 d，用清水冲洗干净；将蜗牛置于烧杯中，注满清水，加入少许乙醚；麻醉处理后的蜗牛软体部分伸展，便于解剖和观察。

2）去壳。用手术剪从壳口开始沿着缝合线，顺着蜗牛壳螺旋的方向剪开壳，直至壳顶；在剪的过程中，蜗牛壳会慢慢脱落下来，用镊子边剪边将碎壳除净。蜗牛的软体部分附着在壳轴上，小心将其从壳轴上取下。剪时注意不要破坏蜗牛的软体结构。去壳后的蜗牛如图1所示。

图1 蜗牛去壳

3）解剖。将去壳的蜗牛软体部分置于蜡盘中，分别在蜗牛头部两侧和足的后部，插入1 根大头针固定于蜡盘中。

将手术剪插入呼吸孔中，顺着领与头部体壁连接处，剪开外套膜。然后调转剪刀方向，顺着外套膜与身体的连接处，稍偏直肠的下缘剪开外套膜，将直肠保留在剪开的外套膜上。

蜗牛的口位于身体前端的头部腹面, 口后肌肉质球状结构称为口球, 口球内有摄食器官颚片和齿舌；口球后与食道相连,食道处与膨大的嗉囊相连； 嗉囊背部有2 个淡黄色分支的管状腺体称为唾液腺，唾液腺由唾液腺管直接通入食道；嗉囊后面称为后食道,直通胃,胃呈袋状；小肠比较长,在内脏囊中迂回盘旋,小肠后面与直肠相接；肛门开口位于身体体右侧近外套腔出口处。顺其消化道剪开体壁剥离消化道（图2），摘取嗉囊。放在pH=5.0 的柠檬酸－磷酸盐缓冲液中。

2.4.2 提取蜗牛消化酶 用注射器吸取13% CPW 洗液5 mL，从消化道的一端插入，反复注射几次。使蜗牛消化道里的消化酶充分洗脱后，置于离心管中待用［3］。

2.4.3 用蜗牛消化酶提取原生质体 取幼嫩的菠菜叶，小心用镊子撕取下表皮，暴露叶肉组织。剪取几小块叶肉组织置于蜗牛消化酶离心管中，酶解1～2 h，过程中可稍微晃动几次。

图2 蜗牛消化道分离

2.4.4 制作临时装片 取2 个洁净的载玻片，用胶头滴管从离心管中吸取酶解后的组织样液，滴1 滴于载玻片的中央，轻轻盖上盖玻片。对照组为菠菜叶肉组织切片。

2.4.5 镜检 先在低倍镜下找到原生质体（图3），再换成高倍镜仔细观察，做好记录。画出在显微镜下看到的原生质体的图像。

图3 低倍镜原生质体

3 结果

完整的原生质体形态上是圆球形，颜色鲜艳，富含细胞质。

实验中所用材料主要是叶肉细胞，因此大部分原生质体均富含叶绿体； 个别原生质体可能是表皮细胞或保卫细胞形成，是无色的观察不到叶绿体。原生质体的大小差异是源于植物体细胞的大小不同。一般生活着的原生质体均是圆球状的，性状扁或者不规则的，往往是死亡的。

4 讨论

该方法具有条件温和、原生质体完整性好、活力高、产率高等优点，但是使用蜗牛酶也存在一定的副作用。由于蜗牛酶是由多种酶组合成的复杂酶系，其中所含的蛋白酶等可能会对细胞膜产生不可逆的伤害，因此在实际科学研究中需要酌情考虑使用该方法。在高中阶段，只需要体验制备原生质体的过程和直观观察原生质体即可，无需考虑其他酶对实验结果的影响。但是在实验过程中一定要把握酶解的时间和温度；时间过短，细胞壁分解不彻底；酶解时间过长，则可能会在其他酶作用下，原生质膜破裂而死亡；酶解的温度过高或过低，细胞壁分离不彻底，将导致不能得到完整的原生质体。