优化苯酚硫酸法测定金线莲中多糖含量

张松柏，陈 磊，许 文，张 勋，徐 伟，林 羽

（福建中医药大学药学院，福建 福州350122）

金线莲（Anoectochilusroburghii（Wal1.） Lindl），又名金线兰、金蚕、乌人参、金线入骨消等，是一种多年生兰科草本植物［1］，主产地为福建。文献报道多糖类、黄酮类、生物碱类、氨基酸类等是金线莲主要化学成分［2］。其中金线莲多糖是其主要药理活性物质，具有降血糖、抗氧化、抗肝损伤、增强免疫功能、抗肿瘤等药用功效［3］，因此测定金线莲多糖可以为金线莲质量标准提供依据。苯酚硫酸法是测定多糖含量的经典方法，但是其对显色条件要求严格，操作要求高［4］。本文旨在优化苯酚硫酸法，提高金线莲多糖含量测定的灵敏度和可操作性。

1 材 料

1.1 仪器 UV-3200紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；AR224CN电子天平（美国奥豪斯仪器常州有限公司）；SC-04低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HWS-12型电热恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试剂 D-无水葡萄糖（中国食品药品质量检定研究院，批号：110833-201506）；硫酸（广东西陇化工有限公司，批号：180922）；苯酚（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：P815401）；超纯水（实验室制备）。

1.3 药材 不同产地金线莲样品8批，经福建中医药大学药学院黄泽豪副教授鉴定为兰科开唇兰属的金线莲（Anoectochilusroburghii（Wal1.） Lindl），样品信息表见表1。

2 方 法

2.1 供试品溶液的制备 精密称取干燥金线莲全草粉末（60℃烘干、过60目筛）0.5 g，置于锥形瓶中；以料液比1∶20加水，60℃超声提取 30 min，3 600 r／min离心15 min，取上清液置于锥形瓶中，重复3次；合并上清液，旋蒸至约20 mL，加入Sevage试剂，离心，重复3次合并上清液；上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃过夜，离心，收集沉淀，冷冻干燥48 h，得金线莲粗多糖［5］。取粗多糖溶解，加水定容于1 000 mL的量瓶中，摇匀即得。

2.2 对照品溶液的制备 精密称定D-葡萄糖50 mg溶于1 000 mL的量瓶中，加水定容，摇匀即得。

2.3 吸收波长确定 精密吸取对照品与供试品溶液0.5 mL，置于具塞玻璃管中，加水补足至1 mL，混匀；加入5 mL硫酸，室温放置60 min；加入4%苯酚1.2 mL，摇匀，50 ℃水浴 25 min，冰浴 5 min，室温放置15 min。以水为空白，自“再加入5 mL硫酸”起，同法操作，作为空白对照。在紫外分光光度计下于300～800 nm扫描全波长图谱。

2.4 显色条件的优化 按照“2.3项”下的显色条件，进行单因素试验，分别优化各显色条件：① 分别加入 4%苯 酚 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL；②分别加入硫酸 4、5、6、7、8、9 mL；③ 加入硫酸后放置时间分别 40、50、60、70、80 min；④ 水浴温度分别为 30、40、50、60、70℃；⑤ 水浴时间分别为 15、25、35、45、55 min；⑥ 冰浴时间分别为 0、5、10、15、20 min。测定各显色条件下490 nm最大吸收波长处吸光度，确定最佳显色条件。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线的绘制 分别精密量取对照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 于具塞玻璃管中，按“2.3项”下显色方法进行操作，490 nm测定吸光度。以葡萄糖含量（μg）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

2.5.2 精密度考察 精密量取供试品溶液0.5 mL，置于具塞试管中，按“2.3项”下显色方法进行操作，490 nm处连续测定5次，求算RSD值。

2.5.3 重复性考察 按“2.1项”制备5份供试品，分别精密量取5份供试品溶液各0.5 mL，置于具塞试管中，按“2.3项”显色方法进行操作，490 nm处测定吸光度，求算RSD值。

2.5.4 稳定性考察 取“2.5.3项”下的显色溶液分别放置 5、15、25、35、45 min，并在 490 nm 处测定吸光度，求算RSD值。

2.5.5 加样回收率试验 分别精密称取已知多糖含量的B1批金线莲样品约0.25 g共6份，加入葡萄糖对照品21.00 mg，按“2.1项”下供试品制备方法，制备得6份供试品；取上述供试品0.5 mL，按“2.3项”下显色方法处理，测定吸光度，得总多糖回收率及RSD值。

3 结果与分析

3.1 吸收波长的确定 按“2.3项”显色方法操作，金线莲供试品与葡萄糖对照品在490 nm处有最大吸收值，故选择测定波长为490 nm。如图1所示。

图1 对照品和供试品在优化方法显色下的紫外吸收图谱

3.2 显色条件优化结果

3.2.1 苯酚用量的确定 精密吸取B1批的金线莲供试品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，按“2.3项”显色方法加入 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 4%苯酚；同法每组以水为空白，加入不同体积苯酚，于490 nm测得吸光度。当苯酚用量为1.2 mL的时候吸光度最大且稳定，故选择1.2 mL为苯酚用量。

3.2.2 浓硫酸用量的选择 精密吸取B1批的金线莲供试品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，按“2.3项”显色方法加入 4、5、6、7、8、9 mL 的硫酸；同法每组以水为空白，加入不同体积硫酸，490 nm处测定吸光度。当硫酸用量5 mL时，吸光度最大且稳定，故选择5 mL硫酸作为用量选择。

3.2.3 加入硫酸后放置时间考察 精密吸取B1批的金线莲供试品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，按“2.3 项”显色方法加入硫酸后，放置 40、50、60、70、80 min；同法以水为空白，测定490 nm处吸光度。加入硫酸放置40～60 min样品吸光度逐渐增加，60 min以后趋于稳定，故选择放置时间为60 min。

3.2.4 水浴温度的选择 精密吸取B1批的金线莲供试品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，按“2.3项”下显色方法加入4%的苯酚1.2 mL，分别置于30、40、50、60、70℃水浴，在490 nm下测定吸光度。 在水浴温度为50℃时吸光度最大，故取50℃为最佳水浴温度。

3.2.5 水浴时间的考察 精密吸取B1批的金线莲供试品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，加水补足至1 mL。按“2.3项”显色方法加入4%的苯酚1.2 mL 以后，50 ℃水浴 15、25、35、45、55 min，490 nm测定吸光度。水浴25 min以后吸光度基本保持不变，故取25 min为最佳水浴时间。

3.2.6 冰浴时间的考察 精密吸取B1批的金线莲供试品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，按“2.3项”显色方法处理，冰浴放置 0、5、10、15、20 min，490 nm处测定吸光度。冰浴5 min以后吸光度保持稳定，考虑到节省时间，故选择冰浴时间为5 min。

3.3 方法学考察结果 以葡萄糖用量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线：

该方法在10.12～50.58 μg葡萄糖用量范围内呈现良好的线性关系。精密度考察中RSD为0.22%，说明仪器精密度良好；供试品重复性试验RSD为3.02%，说明重复性良好；显色溶液放置45 min内RSD为0.14%，样品稳定性良好。平均回收率97.10%，RSD为1.24%，加样回收率结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）

3.4 金线莲样品多糖含量测定 各批次金线莲药材按“2.1项”处理，精密量取供试品溶液0.5 mL置于具塞试管中，加水补至1 mL，以水为空白，按“2.3项”下显色方法，在490 nm处测定8批样品吸光度，计算样品多糖含量：A1、A2为5.16%、4.65%，B1、B2 为 8.69%、10.13%，S1、S2 为 5.45%、5.13%，样品 T1、T2为 4.91%、6.17%。

4 讨 论

苯酚硫酸法测定多糖的机制为多糖在浓硫酸的作用下水解成单糖并迅速脱水，生成糠醛衍生物，糠醛衍生物再进一步与苯酚结合，生成有色化合物，该化合物在300～800 nm的紫外波段有特征吸收［6］，故可在紫外分光光度计下对其进行定量分析。因过量硫酸可能造成紫外负吸收，苯酚与硫酸同时也会发生磺化反应，苯酚用量的微小变化对吸光度影响较大［7］，同时显色条件需要严格控制，所以对苯酚硫酸法进行了优化。

本文通过对传统的苯酚硫酸法进行优化，改变了硫酸与苯酚加入顺序，使硫酸与多糖充分反应生成糠醛化合物［6-7］，糠醛化合物再与苯酚结合，使硫酸与苯酚结合对实验结果不再产生干扰，同时考察了硫酸和苯酚用量等显色条件。金线莲药材多糖含量测定使用优化的苯酚硫酸法，能取得较好的重复性与稳定性。该方法可操作性高，灵敏度高，且加样回收率较高，故此法可用于金线莲药材中多糖含量的测定，为金线莲质量标准的提高提供参考。测定的8批金线莲，多糖含量在4.00%～11.00%，含量差异较大，可能与产地、栽培方式和栽培周期有关。日后将进一步开展实验，探讨多糖含量产生差异的相关研究。