QuEChERS结合液相色谱串联质谱法测定食用菌中13种农药残留

杨路平,邵立君,王国玲,王锡宁,任晓菲,刘拥军

(1.山东大学预防医学研究院,山东济南 250012;2.山东省疾病预防控制中心,山东济南 250012;3.山东省医学科学院药物研究所,山东济南 250062)

中国是世界上主要的食用菌生产国和出口国,食用菌也是中国农业六大支柱产业之一[1]。食用菌生产过程具有密闭、潮湿和不见光等特点,病虫害一直是影响食用菌生产和品质的主要因素之一[1]。蘑菇褐腐病是危害蘑菇栽培业的世界性病害,覆盖土的消毒灭菌和发病后喷施杀菌剂处理仍是目前防治该病害的主要措施,生产上曾先后使用过多种杀菌剂。其中,多菌灵已在蘑菇生产中应用多年,咪唑类杀菌剂咪鲜胺已获准登记在蘑菇上使用,苯醚甲环唑和戊唑醇属甾醇合成抑制剂,是目前国内生产和使用量较大的杀菌剂品种。双翅目类害虫也会危害食用菌的产量和品质。化学防治仍是中国防治食用菌害虫的主要方法,生产上经常使用的杀虫剂有氟虫腈、阿维菌素、吡虫啉、除虫脲、拟除虫菊酯类杀虫剂及植物源农药等。而这些农药并未获得中国农业部批准应用于食用菌害虫防治[2-4]。

国内外对杀菌剂和杀虫类农药残留的研究集中在水[5]、食品[6-9]及水果中[10-11],常用的检测方法包括气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-串联质谱法[12](GC-MS/MS)、液相色谱-串联质谱法[13-17](LC-MS/MS)等。由Anastassiadas等于2003 年提出的快速(Quick)、简单(Easy)、廉价(Cheap)、高效(Effective)、可靠(Rugged)和安全(Safe)的分散固相萃取(QuEChERS)技术,最初用于果蔬中农药残留检测,后被推广至更大的检测范围和基质中,成为农药残留快速前处理技术的首选[18-21]。

本实验通过优化QuEChERS各类填料的不同配比,优化超高效液相色谱-质谱条件,建立了同时测定蘑菇中常用13种农药残留的QuEChERS-LC-MS/MS分析方法,用于蘑菇中13种农药残留测定,为蘑菇食品安全评估检测工作提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

食用菌 按国家食品安全风险监测标准要求于2018年6～7月在山东省17地市采集170份菌类制品,包括55份香菇,32份杏鲍菇,28份海鲜菇,41份金针菇,5份鸡腿菇,9份白玉菇,样品经多功能粉碎机粉碎至匀浆后,密封冷冻备用；甲醇、乙腈 色谱纯,德国Merker;无水硫酸镁 国药集团;N-丙基乙二胺(PSA)、C18、GCB 美国Agilent公司；农药标准品:多菌灵(carbendazim)、甲基硫菌灵(Thiophonate-methyl)、甲霜灵(metalaxyl)、嘧霉胺(pyrimethanil)、烯酰吗啉(dimethomorph)、咪鲜胺(prochloraz)、三唑酮(triadimefon)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、丙环唑(propiconazole)、戊唑醇(tebuconazole)、吡虫啉(imidachloprid)、啶虫脒(acetamiprid)和氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole) 均购于农业部环境保护科研监测所。

UPLC XevoTMTQ-S超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪 美国Waters公司;460/H超声波清洗器 德国Elma公司;HR2860食品粉碎机 Philips公司;Vortex-Genie2涡旋混匀器 美国Scientific公司,Millipore超纯水系统 美国Millipore公司,Sartorius CPA225D电子天平 德国Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 称取 5.0 g 食用菌匀浆(精确至0.01 g)置于50 mL离心管中,加入15 mL乙腈-水(4∶1,V/V),超声250 W提取5 min,加入1 g氯化钠,振荡0.5 min,待液液分层后加入4 g无水硫酸镁,振荡涡旋1 min,10000 r/min室温离心5 min,取上清液1.0 mL,加30.0 mg PSA+15.0 mg无水硫酸镁 涡旋混匀1 min,在10000 r/min室温离心3 min。取上清液,过0.22 μm滤膜,LC-MS/MS进样分析。

1.2.2 标准溶液的配制及标准曲线的绘制 标准储备液的配制:分别准确称取适量的13种农药标准品,用丙酮溶解,配成质量浓度为1000 mg/L 的标准储备液,于-18 ℃下保存,备用。

混合标准储备液的配制:分别准确量取1.0 mL标准储备液于100 mL容量瓶中,用丙酮稀释并定容,配成质量浓度为10.0 mg/L的混合农药标准储备液,于-18 ℃下保存,备用。

基质匹配标准溶液的配制:取未检出农药残留的食用菌匀浆,依1.2.1法处理,得到待进样清液,作为空白基质溶液。用基质空白溶液稀释混合标准储备液,分别配成质量浓度为0.005、0.01、0.025、0.05、0.1和 0.2 mg/L的标准工作溶液。以13种农药的标准工作溶液的质量浓度为横坐标,各物质的定量离子对峰面积为纵坐标,绘制各物质的基质匹配标准曲线。

1.2.3 仪器条件的优化

1.2.3.1 色谱柱的选择 本试验考察了BEH C18、HSS T3两种色谱柱对目标化合物色谱行为的影响。

1.2.3.2 流动相的选择 本试验对不同流动相体系(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液)进行了考察。

1.2.3.3 质谱条件的优化 采用直接进样方式,分别对浓度为0.5 mg/L的13种农药标准溶液做正离子和负离子全扫描分析,以获得丰度较高的母离子。在此基础上,对各待测物的母离子进行子离子扫描,选取响应最强的两对MRM离子对,分别作为定量离子对和定性离子对,软件自动优化其Q1、Q3偏置电压及碰撞能等质谱参数,使子离子的响应达到最佳。

1.2.4 样品前处理的优化

1.2.4.1 萃取溶剂的选择 取已制备的蘑菇样品加标后进行前处理,在萃取过程中,分别考察甲醇、乙腈以及不同比例的甲醇-水、乙腈-水混合溶液作为提取溶剂的提取回收率。

1.2.4.2 净化剂的选择 取已制备的蘑菇样品加标后进行前处理,在萃取液净化过程中,分别考查PSA和无水硫酸镁对13种农残回收率的影响。

1.2.5 色谱质谱条件 色谱条件:ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),流动相A为0.1%甲酸溶液,B为乙腈,梯度洗脱:B相在1.0 min内线性由10%增加到50%,1～2.5 min由50%增加到60%,2.5～8 min由60%增加到95%,然后在0.5 min内降至10%,保持2.0 min;流速0.3 mL/min,进样量5.0 μL,柱温:35 ℃。

质谱条件:电喷雾离子源正离子模式;多反应监测;毛细管电压:2.0 kV;萃取锥孔电压:20 V;RF透镜电压:0.5 V;离子源温度:150 ℃;脱溶剂气温度:500 ℃;锥孔气流速:50 L/h;脱溶剂气流速:800 L/h;倍增器电压:650 V;二级碰撞气:氩气;13种农药串联质谱多反应监测模式下的检测条件见表1。

表1 13种农药多反应监测模式下的检测条件Table 1 Multiple reaction monitoring conditions for the determination of 13 pesticides

1.2.6 标准曲线的绘制及回收率测定 由于蘑菇复杂基质的影响,采用基质匹配法绘制标准曲线能更好的消除ME对定量的影响。取未检出农药残留的食用菌为空白样品,按照1.2.1的前处理方法,制备成母液。在上述制备母液中添加混合标准溶液,形成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、200 μg/L的基质标准液,经UPLC-MSMS分析后,以13种农残的标准溶液浓度x(μg/L)为横坐标,各自定量离子的峰面积y为纵坐标,绘制校正曲线。取未检出农药残留的食用菌为空白样品,进行添加回收率和精密度试验,分别添加0.05,0.25和1.0 μg三个质量浓度的13种农药混合标准溶液适量,使样品中最终浓度为0.01,0.05和0.2 mg/kg,混匀,静置30 min,使标准溶液被空白样品充分吸收,依1.2.1法进行前处理和测定,每个浓度测定5次,计算其平均加标回收率和相对标准偏差(RSD%)。

1.3 数据处理

Masslynx software V 4.1(Waters,USA)软件进行数据采集及处理,Excel 2017进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择 本试验考察了BEH C18、HSS T3两种色谱柱对目标化合物色谱行为的影响。由图1可见相对于BEH C18柱,HSS T3柱获得较好的分离效果,图1以T3柱保留时间为4.51 min丙环唑为例,其C18柱保留时间为4.17 min,但4.23 min处出现肩峰,使用HSS T3柱,目标化合物的峰形更好,响应更高,基线噪音更低,因此本试验选择HSS T3柱为分析柱。

图1 BEH C18、HSS T3色谱柱的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of HSS T3 column and BEH C18注:a为丙环唑在T3柱的提取离子流图；b为丙环唑在C18柱的提取离子流图；c为13种农残在T3柱的总离子流图；d为13种农残在C18柱的总离子流图。

2.1.2 流动相条件的优化 通过比较不同流动相体系(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液,结果显示0.1%甲酸的加入使13种待测物在较短时间内实现了更好的分离,得到了理想的灵敏度和分辨率,峰形良好,采用乙腈为有机相时,与甲醇比较,目标化合物具有更高的灵敏度和更好的分离度,因此本试验采用乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相梯度洗脱。优化后的混合标准溶液的总离子流色谱图见图2,13种化合物的提取离子流图见图3。

图2 混合标准溶液的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of mixed standard solution

图3 13种化合物的提取离子流图Fig.3 Ion chromatogram of 13 compounds注:a表示相对丰度。

2.1.3 UPLC-MS/MS 条件优化 通过对质谱条件的优化,所采用的参数见表1。结果表明13种农残都具有较高的质谱响应,满足实验要求的灵敏度。

2.2 样品前处理方法的考察

2.2.1 萃取溶剂的选择 通过比较甲醇、乙腈以及不同比例的甲醇-水、乙腈-水混合溶液作为提取溶剂的提取回收率,结果见图4,由图可见乙腈-水作为提取溶剂时13种农药的回收率在85%～105%之间,比甲醇-水作为提取溶剂的回收率高出8%以上,乙腈的体积分数达到75%～80%时,提取效率最高,因此选择乙腈-水(4∶1,V/V)作为提取溶剂。

图4 采用不同提取溶剂所得到13种农药的回收率Fig.4 Recoveries of 13 pesticides with different extraction solvents

2.2.2 净化剂的选择 QuEChERS净化法是近年来国际上最新发展起来的具有快速、简单、便宜、有效、可靠和安全等特点的样品前处理技术,一般采用PSA、C18和GCB等吸附剂进行样品净化。PSA可用于去除各种有机酸、色素及一些糖类和脂肪酸;C18可用于去除脂肪类化合物;GCB可用于去除类甾体、叶绿素等色素。该试验对比了混合标准溶液经过PSA、C18和GCB三种不同吸附剂和未使用吸附剂时的回收率见图5,发现PSA对13种农药的回收率均较好,在70%以上,这可能是因为PSA吸附剂具有弱的阴离子交换能力,有利于吸附样品基质中的有机酸、糖和色素,对农药有较高的回收率。而其他2种吸附剂净化后的农药回收率较低,因此,本试验选择PSA作为QuEChERS净化的吸附剂,并添加了无水硫酸镁粉末,起到除水的作用。本文考察了PSA的使用量(20.0、30.0和40.0 mg),结果见图6,表明PSA的使用量对基质效应没有显著的影响(53.4%、48.2%和47.2%),回收率结果见图7,回收率随着PSA用量的增加略有降低(87.4%、85.6%和80.5%),所以我们选用30.0 mg PSA。我们比较了三种组合:a.30.0 mg PSA+10.0 mg无水硫酸镁;b.30.0 mg PSA+15.0 mg无水硫酸镁;c.30.0 mg PSA+20.0 mg无水硫酸镁;平均回收率见图8,没有显著区别(86.7%、87.4%和85.9%),最终选用30.0 mg PSA+15.0 mg无水硫酸镁。

图5 不同净化剂对回收率的影响Fig.5 Effect of different purificant on recovery

图6 PSA的不同用量对13种农残基质效应的影响Fig.6 Effects of different dosage of PSA on matrix effects of 13 kinds of pesticide residues

图7 PSA的不同用量对13种农残回收率的影响Fig.7 Effects of different dosage of PSA on recovery rate of 13 kinds of pesticide residues

图8 无水硫酸镁的不同用量对13种农残回收率的影响Fig.8 Effects of different dosage of MgSO4 on recovery rate of 13 kinds of pesticide residues

2.3 基质效应、工作曲线及检出限

基质效应的存在对准确检测有着不可忽视的影响,试验中以ME=Slopi/Slop0评价基质效应,其中ME为基质效应,Slopi为基质匹配标准曲线的斜率,Slop0为纯溶剂标准曲线的斜率。当ME在0.90～1.10之间时,基质效应可以不考虑;当ME大于1.10 时,为基质增强效应;当ME小于0.90时,为基质抑制效应。以空白蘑菇为基质,结果表明,除了甲霜灵、嘧霉胺、三唑酮三种杀菌剂外其他10种农药均有不同程度的基质抑制效应,见表2。因此,在试验中采用基质匹配标准曲线以减少基质效应对试验结果的影响。配制13种农药系列混合标准溶液进行测定,以峰面积(y)对浓度(x,μg/L)进行线性回归,其线性关系良好,以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)分别确定检出限(LOD)与定量限(LOQ)。方法的线性范围0.5～200 μg/L,LOD与LOQ见表2所示,结果表明,13种目标化合物在所选定的浓度范围内线性关系良好,相关系数(r)相关系数在0.9991～0.9999之间,检出限在0.03～0.3 μg/kg之间,定量限在0.1～1 μg/kg之间。

表2 13种农药基质匹配曲线线性范围、回归方程和相关系数Table 2 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits of 13 pesticides

2.4 方法的回收率与精密度

取未检出农药残留的食用菌为空白样品,进行添加回收率和精密度试验,依1.2.6法进行前处理和测定,结果见表3,13种农药的加标回收率在84.3%～102%之间,测定值的相对标准偏差在2.8%～6.3%之间。

表3 13种杀菌剂的添加回收率和相对标准偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of 13 fungicides(n=5)

2.5 实际样品分析

按试验方法对山东省17地市采集的170份食用菌进行分析,其检出结果见表4,其中“/”表示未检出。13种农药残留中的8种有检出,检出率最高的是多菌灵,为45.3%;其次是烯酰吗啉为28.8%;三唑酮、苯醚甲环唑、丙环唑、戊唑醇、甲霜灵五种均未检出。GB2763-2016食品中农药最大残留限量中,规定咪鲜胺在蘑菇类的限量为2 mg/kg,对本试验中其他12种农药目前还没有相关检测方法和残留的限量规定。本实验咪鲜胺的检出率为13.5%,样品中最大值为5.4 μg/kg,所有样品均小于2 mg/kg的限量规定。

表4 13种农药残留在170份菌类样品中的检出率及浓度范围Table 4 Detection rate and concentration rage of 13 pesticide residues in 170 fungus samples

3 结论

本工作建立了分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食用菌中13种杀虫杀菌剂的方法。与传统检测方法相比,样品前处理过程简单,试剂消耗量少、样品分析成本低。此外,分散固相萃取技术与液相色谱-串联质谱的联用使得信噪比更高、干扰更少,其LOQ可达到0.1 μg/kg,在实际检测中具有较强的可行性和实用性,可满足菌类样品中农药残留的监测要求。GB2763-2016食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量[22],标准只对食用菌(鲜蘑菇)中的20种农药残留有相关的限量规定[18],而市场上的农药有上百种可能被用于蘑菇种植中以起到杀菌和杀虫作用,因此建立完善食用菌中多种农药残留的检测方法和限量标准的制定是十分必要的。实验所得170份食用菌中13种农药残留数据为政府监督部门制定食品安全标准提供了数据支持。