酿造酒中非酿酒酵母的研究进展

卜光明,周化斌,周茂洪,杨海龙,*

(1.浙江瑞邦药业股份有限公司,浙江温州 325000;2.温州大学生命与环境科学学院,浙江温州 325035)

在人类历史进程中,酒类饮品在经济和文化等方面发挥着独特而重要的作用,考古证据表明最古老的酿造酒出现在公元前7000年的中国[1],是多种微生物共同作用的产物,其中最主要的是酵母菌,它通过代谢水果、谷物、蜂蜜和其它原料中的糖产生酒精。酒精发酵以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为主,但许多非酿酒酵母(non-Saccharomyces)也参与其中,不但将糖转化成为酒精和二氧化碳,并通过其他一系列复杂的生化反应生成甘油、杂醇、醛类及酯类等物质。酿造酒的风味受原料来源与品质、酿造工艺、陈酿条件等多种因素影响,非酿酒酵母的代谢能改善酒体的口感、风味及香气,赋予酿造酒地域特色。

1987年Heard等[2]首次研究报道了酿酒过程中出现的克勒克酵母(Kloeckera)、假丝酵母(Candida)、汉生酵母(Hansenula)以及有孢汉生酵母(Hanseniaspora)等非酿酒酵母菌株,此后非酿酒酵母的研究成为酿酒领域的热点之一。本文对近十几年来酿造酒中非酿酒酵母的研究方法、生长条件及其在酿造中的作用进行综述,并分析了存在的问题,以期为非酿酒酵母优良菌株的开发利用提供参考。

1 非酿酒酵母种类分析及群落多样性的研究方法

传统的微生物研究是将菌株分离纯化,然后进行形态、生理生化及分子生物学分析。但是大多数非酿酒酵母对酒精敏感,只存在于发酵的早期阶段,随着发酵的进行,非酿酒酵母在几个小时内就会逐渐被酿酒酵母所取代[3],所以传统的纯培养方法只能显现少数非酿酒酵母的信息,不能充分反映酵母群落的多样性,导致一些具有应用价值的酵母信息被遗漏。近年来,随着分子生物学的发展,基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的非培养分析技术在酵母多样性和群落分布研究中不断应用,如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多态性、限制性片段长度多样性(RFLP)、核糖体间隔基因自动分析(ARISA)、宏基因组学、荧光原位杂交(FISH)、荧光定量PCR、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、串联重复序列(Tandem repeat)分析等,不但可以直接确定不同样品中酵母的种类及其丰度,并且可以建立可靠的酵母群系指纹图谱,确定酵母群系在时间和空间上的变化规律[4]。

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)是常用技术之一,Romancino等[5]采用PCR-RFLP技术分析了意大利Sicily地区葡萄汁中的非酿酒酵母,确定了分属假丝酵母、有孢汉生酵母、伊萨酵母(Issatchenkia)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、梅氏酵母(Metschnikowia)、有孢园酵母(Torulaspora)的10个种;Ubeda等[6]亦以PCR-RFLP技术确定西班牙La Mancha地区酿酒厂的非酿酒酵母分属有孢园酵母、假丝酵母、接合酵母(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)、有孢汉生酵母、克鲁维酵母、绪方酵母(Ogataea)和路德类酵母(Saccharomycodes);Lv等[4,7]通过PCR-RFLP指纹图谱对福建红曲黄酒酿造用酒曲中的酵母菌进行分型,确定含有季也蒙毕赤酵母(P.guilliermondii)、扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、弗比恩毕赤酵母(P.fabianii)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、核桃隐球酵母(Cryptococcusheveanensis)、浅白隐球酵母(Cry.albidus)、马朗复膜孢酵母(Saccharomycopsismalanga)、尼兰掷孢酵母(Sporobolomycesnylandii)、异常维克氏酵母(Wickerhamomycesanomalus)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、粘性红圆酵母等非酿酒酵母菌;David等[8]应用焦磷酸测序技术和PCR-ITS-RFLP检测技术研究了酿酒过程中酵母菌的多样性及酵母群动态分布。

串联重复序列(Tandem repeat)广泛存在于真核生物和一些原核生物的基因组中,并表现出种属、碱基组成等的特异性。串联重复序列分析可应用于微生物菌株鉴别、基因分型等方面。绝大多数非酿酒酵母的基因组序列未知,串联重复序列-tRNA结合了基于串联重复的不同寡核苷酸和基于保守的tRNA区域的第二寡核苷酸,可用于菌株多样性分析。Barquet等采用PCR分析非酿酒酵母的串联重复序列-tRNA,成功地确定了美极梅氏酵母(M.pulcherrima)、维尼有孢汉生酵母(H.vineae)、葡萄有孢汉生酵母(H.uvarum)、仙人掌有孢汉逊酵母(H.opuntiae)、泽兰假丝酵母(C.zemplinina)的菌株多样性[9]。

另外,为了实时监测酵母培养过程中的状况,研究人员开发了基于红外辐射吸收的分析技术非破坏性分析方法,根据细胞的不同成分的傅立叶变换红外光谱(FT-IR)来鉴定分离物。FT-IR技术能够鉴定葡萄汁中的大部分非酿酒酵母种类,分析其多样性,具有操作简便、不破坏细胞结构的特点,是研究酿造酒中非酿酒酵母的新技术[10]。

2 非酿酒酵母及影响其生长的因素

过去,非酿酒酵母菌往往被忽略或被认为是不受欢迎的腐败酵母菌,随着对酿酒微生物的深入研究,发现在酿酒酵母的基础上添加适当的非酿酒酵母菌株,可以酿造出风格独特、类型多样的产品。传统绍兴黄酒的发酵醪中,酵母种类极为丰富,绍兴黄酒麦曲中含有毕赤酵母属、红酵母属、锁掷酵母属的非酿酒酵母[11]。毛青钟[12]对传统工艺生产的元红酒、加饭酒和善酿酒的发酵醪中和淋饭酒母中酵母的分离,获得55株酵母菌,这些菌在黄酒酿造过程中呈动态变化,发酵初期,60%为酿酒酵母,35%为果酒和葡萄酒酵母,5%为其他酵母,而发酵后期低耐酒精度的酵母死亡并自溶,分解成各种氨基酸、核酸和维生素等营养物质和多种风味物质;目前从不同地区的葡萄酒[5,6,13-15]、黄酒[11-12]、苹果酒[17]、龙舌兰酒[18]等产品酿造相关分离物中获得了酒香酵母(Brettanomyces)、假丝酵母、棒孢酵母(Clavispora)、隐球酵母(Cryptococcus)、有孢汉生酵母、汉生酵母、伊萨酵母、克鲁维酵母、克勒克酵母、克里格范瑞吉酵母(Kregervanrija)、拉钱氏酵母(Lachancea)、洛德酵母(Lodderomyces)、梅氏酵母、迈耶氏酵母(Meyerozyma)、米勒氏酵母(Millerozyma)、绪方酵母、毕赤酵母、普来氏酵母(Priceomyces)、红酵母(Rhodotorula)、路德类酵母、复膜孢酵母、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、掷孢酵母、世达梅乐酵母(Starmerella)、有孢园酵母、威克氏酵母、接合酵母等非酿酒酵母菌属中的菌株,其中以季也蒙有孢汉逊酵母(H.guilliermondii)、异常威克氏酵母(W.anomalus)、德布尔有孢酵母(T.delbrueckii)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)最为常见。不同地区的非酿酒酵母存在差异,意大利Sicily地区葡萄汁中的非酿酒酵母主要有星状假丝酵母(C.stellata)、季也蒙有孢汉逊酵母、奥斯曼有孢汉逊酵母(H.osmophila)、葡萄有孢汉生酵母、陆生伊萨酵母(I.terricola)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、美极梅氏酵母、德布尔有孢酵母、拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)等[5];而意大利Apulian地区除季也蒙有孢汉逊酵母、葡萄有孢汉生酵母、陆生伊萨酵母、拜氏接合酵母,还检测到博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、泽兰假丝酵母、仙人掌有孢汉逊酵母等种类[19];宁夏贺兰山东麓葡萄种植园土样和葡萄果实表面上附着的非酿酒酵母以德布尔有孢酵母、葡萄有孢汉生酵母、异常汉生酵母(Hansenulaanomala)和东方伊萨酵母(I.orientalis)为主[20]。

非酿酒酵母中有些种类有助于葡萄酒的发酵、增加口感与芳香风味,而有些种类会导致发酵延迟、并可能产生不良风味。在葡萄汁中充入饱和CO2可以抑制不利菌株杆状世达梅乐酵母(Starmerellabacillaris)与葡萄有孢汉生酵母的生长,促进有益菌株德布尔有孢酵母与克鲁维毕赤酵母(P.kluyveri)的增殖[14]。Shekhawat等[21]研究表明氧含量对非酿酒酵母的生长影响显著,德布尔有孢酵母和普尔切梅氏酵母可在微氧条件增殖,而耐热拉钱氏酵母(L.thermotolerans)的增殖基本无需氧的参与。

葡萄汁中的氮源对酵母的生长代谢影响极大,氮源限制可增加非酿酒酵母的丰度[22],不同氨基酸影响非酿酒酵母的生长,杆状世达梅乐酵母最适氨基酸为丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸,美极梅氏酵母最适氨基酸为丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、苏氨酸,而膜璞毕赤酵母(P.membranifaciens)最易于吸收的氨基酸为半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸和苏氨酸[23];氮源限制及提高芳香氨基酸的浓度可显著促进葡萄有孢汉生酵母Hv4菌株、杆状世达梅乐酵母Cz4菌株、普尔切梅氏酵母Mpp菌株和德布尔有孢酵母Tdp菌株合成芳香醇,但低浓度的葡萄糖会减少芳香醇的合成[24]。

3 非酿酒酵母在酿酒中的作用

3.1 降低乙醇含量

基于健康的考虑,消费者日益趋向于选择低酒精度的酿造酒。采用精馏、蒸发、反渗透等物理方法可以去除酿造酒中的部分乙醇,但会导致风味的劣化。布鲁德氏酵母(DekkerabruxellensisAWRI1127)、季也蒙梅氏酵母(M.guilliermondii)、霍氏毕赤酵母(P.holstii)、膜璞毕赤酵母、异色毕赤酵母(P.anomala)、红掷孢酵母(Sporobolomycesroseus)等非酿酒酵母不产乙醇,星状假丝酵母、异色德氏(D.anomala)、法尔皮有孢汉生酵母(H.valbyensis)、发酵毕赤酵母(P.fermentans)产乙醇能力较酿酒酵母弱得多[25],可用于低醇产品的酿造。Hu等[26]采用有孢汉生酵母(H.uvarum、H.opuntiae、H.occidentalis)、库德里亚毕赤酵母(P.kudriavzevii)和德布尔有孢酵母酿造橘子酒,与酿酒酵母相比,酵母增殖数量低(7.8～8.0lg cfu/mL)、酒精度低(4.13%～7.79%);德布尔有孢酵母只能利用麦芽汁中的葡萄糖、果糖和蔗糖,而不能分解麦芽糖、麦芽三糖,可用于酿造乙醇浓度低至 0.9%(v/v)的啤酒产品[27]。

3.2 产酶能力

非酿酒酵母可分泌酯酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、果胶酶、果糖基转移酶、木聚糖酶、淀粉酶等酶类[13,32-33],在酿造过程中可以提高原料的利用率,水解糖苷类成分释放出芳香化合物增加酒的风味。葡萄有孢汉生酵母分泌的糖苷酶可水解芳香糖苷类,释放萜烯类成分,提高葡萄酒的花香、甜香、浆果和坚果的香气[28];美极梅氏酵母分泌α-阿拉伯呋喃糖苷酶合成萜烯和硫醇类芳香化合物,提高风味[29];李婷等[30]从川南白酒窖池中分离1株高产酯酶的发酵毕赤酵母菌株,具有较高的C4～C8酯酶活性,可用于葡萄酒酿造的增香;毛青钟等[31]研究表明,黄酒酒药和淋饭酒母中大量存在的复膜孢酵母可产α-淀粉酶,能分解生料和熟料淀粉,也能产生糖化酶,分解淀粉为葡萄糖,提高黄酒酿造的原料利用率。研究报道产果胶酶的菌株包括假丝酵母(C.stellata)、毕赤酵母(P.kudriavzevii)、维克氏酵母(W.anomalus)[13];假丝酵母(C.sakeBCS403)菌株可产木聚糖酶[34];有孢汉生酵母(H.uvarum、H.vineaeHv3)、梅氏酵母(M.pulcherrima)、毕赤酵母(P.membranifaciens)、维克氏酵母(W.anomalus)能产β-木糖苷酶[32,35];具有分泌β-葡萄糖苷酶能力的菌株最多,包括假丝酵母(C.sakeBCS403)、有孢汉生酵母(H.uvarumHu8、H.guilliermondii)、拉钱氏酵母(L.thermotolerans)、梅氏酵母(M.pulcherrima)、毕赤酵母(P.anomala、P.membranifaciensPm7)、红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)以及维克氏酵母(W.anomalusWa1)等[13,28,36]。

3.3 产生风味物质

非酿酒酵母改善酒的风味一是分泌酶降解糖苷键释放芳香化合物,二是通过自身代谢直接合成或调整风味成分,非酿酒酵母合成的主要风味成分见表1。德布尔有孢酵母可减少乙醇和乙酸的形成,增加琥珀酸、乳酸和高级醇的含量;酿酒复膜孢酵母(Saccharomycopsispombe)可代谢几乎所有的苹果酸,产生更多的甘油、乙醛和丙酮酸[37];Whitener等[38]研究表明,与酿酒酵母相比,耐热拉钱氏酵母增加2-苯乙醇和丙酸苯乙酯的含量,美极梅氏酵母可产生更多的2-甲氧基-4-乙烯基苯酚,德布尔有孢酵母可增加丙酸苯乙酯的含量;卡利比克毕赤酵母(P.caribbicaUFLA CAF733)发酵可提高2-苯乙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯和苯乙酸乙酯等挥发性成分的含量[39];美极梅氏酵母有助于增加葡萄酒中是酯类、高级醇和萜烯类的含量,提高了美乐低醇桃红葡萄酒香气品质[40];原苗苗等[41]比较了不同非酿酒酵母产香差异,结果表明美极梅氏酵母产生的发酵香气浓度最高(206.27 mg/L),其中有玫瑰花香的苯乙醇以及3-甲基丁醇对香气的贡献最大,浅白隐球酵母产生的金合欢醇能给葡萄酒带来柔和的甜香气,葡萄有孢汉逊酵母能够产生较为丰富的香气物质,典型的发酵香气为乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、辛酸乙酯、辛酸-3-甲基丁酯、乙酸-2-苯乙酯、辛酸和香茅醇,赋予葡萄酒复杂的果香和花香;德布尔有孢酵母可形成乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙醛等风味成分,从而使啤酒具有果香味[27]。刘景等[42]分离获得的平常假丝酵母(C.inconspicua)T2 菌株发酵苹果汁可产生乙酸苯乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、苯乙醇等风味成分,可以显著改善苹果汁发酵风味,适于生产低醇苹果汁饮料。

表1 非酿酒酵母在改善酒体风味中的作用Table 1 The role of non-Saccharomyces in improving wine flavor

乙酸异戊酯、丁二酸二乙酯和乙酸-2-苯乙酯是由酵母在后续发酵过程中通过酯合成途径合成。陈玉香等[43]对比不同酿酒酵母产酯能力,结果表明扣囊复膜孢酵母Y1菌株相对较弱,浅白隐孢酵母Y19菌株具有很强的产辛酸乙酯的能力,赋予黄酒玫瑰、橙子的花果香。

在传统起泡酒酿造工艺中,二次发酵时采用路德类酵母(Saccharomycodesludwigii)和酿酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)代替酿酒酵母,不但可以完成起泡酒的酿造,而且风味、口感俱佳,红色起泡酒中含有更多的花青素,色度更强[44];González-Royo等[45]在葡萄汁中先接入德布尔有孢酵母或者美极梅氏酵母发酵24～36 h,然后再接入酿酒酵母进行酒精发酵,德布尔有孢酵母可以增加甘油的形成,减少挥发性酸的产生,同时可增加产品的起泡性和泡持性;美极梅氏酵母可增加产品的泡持性,并提高其烟熏味及花香味。

3.4 非酿酒酵母与酿酒酵母相互作用酿造高品质产品

非酿酒酵母与酿酒酵母共同参与酒精发酵,但酿酒酵母的代谢产物会抑制非酿酒酵母的生长,而不同的菌株在发酵中存在的时间各异,美极梅氏酵母MJS22菌株与酿酒酵母间存在强烈的拮抗作用,导致美极梅氏酵母MJS22过早死亡,但酿酒酵母对德布尔有孢酵母Alpha菌株的生长几乎无抑制作用[49]。杆状世达梅乐酵母(Starmerellabacillaris)、德布尔有孢酵母(T.delbrueckii)在混合发酵中的存在时间较葡萄有孢汉生酵母(H.uvarum)和美极梅氏酵母(M.pulcherrima)要长[50];维尼有孢汉生酵母(H.vineae)、葡萄有孢汉生酵母、美极梅氏酵母、杆状世达梅乐酵母、德布尔有孢酵母CECT13135在葡萄酒酿造过程中会与酿酒酵母竞争营养,从而导致发酵迟缓或停止,添加磷酸二铵和复合维生素可以有效地防止发酵迟缓的发生[51]。非酿酒酵母对酿酒酵母的生长代谢具有促进作用,Curiel等[52]采用转录组分析研究了厌氧条件下德布尔有孢酵母对酿酒酵母生长代谢的影响,确定可以促使与细胞增殖和糖代谢相关基因的过量表达,而有氧条件下葡萄有孢汉生酵母和清酒假丝酵母可促进酿酒酵母葡萄糖和氮代谢。

发酵过程中非酿酒酵母的生长代谢可以提高原料的利用率、合成风味成分增加酒体的芳香,但酿酒酵母仍是发酵过程不可或缺的组分,研究人员将不同的非酿酒酵母与酿酒酵母进行组合,达到抑制其不良作用,发挥优良功能的目的。Lleixà等[22]确定在非酿酒酵母与酿酒酵母顺序发酵葡萄酒工艺中,接种酿酒酵母的最佳时间是发酵前48 h,这样可以保证营养不被非酿酒酵母过度消耗,但如在前24 h接种酿酒酵母会显著减少酿造过程中非酿酒酵母的丰度;分别采用耐热拉钱氏酵母(L.thermotolerans,LT)、需氧哈萨克酵母(Kazachstaniaaerobia,KA)、克鲁维毕赤酵母(P.kluyveri,PK)、美极梅氏酵母(M.pulcherrima,MP)接入葡萄汁发酵至酒精度为2%,然后接入酿酒酵母(SC)完成酒精发酵,与纯酿酒酵母发酵相比,LT-SC 发酵形成不同种类的酯类、醇和萜类,其中KA-SC组合形成大量的挥发性酸,PK-SC组合形成较多的乙醛,MP-SC组合形成较高浓度的酯类[53];10%酿酒酵母和90%的德巴利酵母(Debaryomycesvanrijiae)混合接入葡萄汁可形成高浓度的萜烯和高级醇,1%酿酒酵母和99%的C.sake混合可合成大量酯类和脂肪酸[34];将有孢汉生酵母(H.osmophilaHa32)、毕赤酵母(P.anomalaPi9)、路德类酵母(SaccharomycodesludwigiiSd64)、接合酵母(ZygosaccharomycesflorentinusZy424)与酿酒酵母混合发酵葡萄汁,可以提高产品中多糖的含量,改善乙酸以及乙酸乙酯、乙酸苯乙酯和2-甲基-1-丁醇等挥发性成分的浓度[54];酿酒酵母与克鲁维毕赤酵母、耐热拉钱氏酵母或者美极梅氏酵母顺序接种发酵葡萄酒可以改善丙酮酸、甘油、乙醛、高级醇、乙酸酯、乙酸苯乙酯和萜类的含量[55]。李艺凡等[56]将从红茶菌液中分离得到的克鲁斯假丝酵母(C.cruseiH8)菌株与全美梅氏酵母、葡萄有孢汉生酵母按1∶1∶1的比例混合,经过46 h 培养后,与酿酒酵母顺序接种发酵赤霞珠红葡萄酒,可形成大量的苯乙醇、薄荷醇、柠檬烯、十一醛、肉豆蔻醛等风味物质,丰富酒体的特征相香气成分。

在其它果酒发酵方面,酿酒酵母与美极梅氏酵母JS22菌株组合显著提高樱桃酒中高级醇、乙酸酯、萜烯类成分的含量,酿酒酵母与德布尔有孢酵母Alpha菌株组合可提升樱桃酒的果香味,减少青涩味[49];剧柠等[57]将分离获得的有孢汉逊酵母葡萄有孢汉生酵母GF-60菌株与商用酿酒酵母以3∶1比例混合发酵枸杞果酒,经GC-MS 测定分析,与酿酒酵母单独发酵相比,混种发酵提高了辛酸乙酯、癸酸乙酯、4-羟基-2-丁酮等的香气成分含量;Nuez-Guerrero等[18]从龙舌兰汁中分离获得了非酿酒酵母菌株德布尔有孢酵母ITD-00014a,25%的德布尔有孢酵母ITD-00014a与75%的酿酒酵母菌株ITD-00185混合发酵,酿造的龙舌兰酒产率高、富含酯类、萜类挥发性成分。

4 展望

酿酒过程中,酵母对酿造酒风味质量具有重要影响,不同的非酿酒酵母产生的不同代谢产物可赋予酒体独特的口感和香气。目前,国内外大部分酿造酒的生产采用商业酿酒酵母,难于突出产品的特点,选择性能优良的非酿酒酵母菌株提高酿造酒的品质已经成为当前研究的主要方向。有关非酿酒酵母的研究主要集中于葡萄酒酿造,并且将非酿酒酵母与酿酒酵母结合发酵葡萄酒的工作仍处于实验室或中试阶段,同时对于黄酒、啤酒及其它特色果酒酿造中非酿酒酵母的作用认识非常有限,因此,在特色非酿酒酵母菌株的筛选、改造及工业化应用方面需要进一步深入研究,以酿造出口感饱满、风格独特的产品。另外,部分非酿酒酵母具有良好的益生活性[58],但目前缺乏详细、深入的研究,筛选活性优良的菌株,并将其与酒的酿造相结合,以酿造具有保健功效的产品是非酿酒酵母研究的另一重要方向。