高效降胆固醇降甘油三酯乳酸菌的分离鉴定和功能分析

吴慧昊,牛 锋,钟 琦,杨 迪

(1.西北民族大学实验中心,甘肃兰州 730030;2.西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;3.湖北省当阳市动物疫病预防控制中心,湖北当阳 444100)

胆固醇是人体必需的营养成分,在体内承担着重要的生理功能,然而人体血清中胆固醇含量往往过高,血清胆固醇过高所造成的一系列心血管疾病严重影响人类健康,现代研究已发现,动脉粥样硬化、静脉血栓形成与高胆固醇血症有密切的相关性[1-5]。WTO预测,到2030年心血管疾病将是导致死亡的主要原因,影响全世界约2.36亿人们的健康。据报道,西欧国家和东欧国家的心脏病发生是由血胆固醇过多造成[6]。与正常血脂水平人群相比,高血脂人群具有高出3倍的心脏病诱发风险。甘油三酯(Triglyceride,TG)是人体内含量最多的脂类,大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量。但如果甘油三酯过量,则可造成动脉硬化、冠心病、心梗、脑卒等[7-8]。

目前,主要通过他汀类药物控制高血脂症,但该种药物具有严重的毒副作用,容易造成肌痛、头痛、胃肠不适、肝肾功能损害等副作用[9-11]。他汀类药物的较严重的不良反应之一是横纹肌溶解[12-13]。西立伐他汀(拜斯亭)由于严重的致横纹肌溶解及肾衰竭,于2001年8月在世界范围内收回,它已导致美国及欧洲部分地区52例病人死亡的事故[14]。

益生菌作为“有生命的绿色药品” 已被研究证明具有优效、安全、符合生态等诸多优点,已被越来越多的应用于人类疾病的各个领域[15-17]。科学家先后通过对常饮酸乳人群的调查以及直接对酸乳的研究等发现,乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用。本研究从6种乳制品样品中筛选出具有降胆固醇、降甘油三酯,同时具有抑制有害菌生长功能的乳酸菌,将其应用于新型药物、保健食品的制备,对保护人体健康具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

6种样品 来自于兰州浆水、新疆奶酪、玛曲酸奶、泽库酸奶、兰州腌菜、藏獒肠道处,并于低温冰箱厌氧保存备用;枯草芽孢杆菌(实验室前期分纯菌株)、大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923 保存于实验中心厌氧微生物实验室;SPF级昆明雌性小白鼠 8周龄,体重在20～22 g,由兰州大学医学院动物饲养中心提供;MRS固/液体培养基 配制方法见文献[18]；高胆固醇MRSO-CHOL培养基 准确称量胆固醇0.1 g放入小烧杯中,加入0.2 g牛胆盐、0.1 g蔗糖酯、1 mL吐温80搅拌均匀,再移取5 mL的冰乙酸加热溶解,用超声波处理15 min后,快速加入到配制好的MRS液体培养基中,边加入边搅拌,使其形成均匀稳定的胶体溶液。

MLS-3750全自动高压灭菌器 日本三洋贸易株式会社;TU-1900双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;GL-21M高速冷冻离心机 赛特湘仪离心机仪器有限公司;PB-10 pH仪 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;BX51T-32P01 数码光学显微镜 日本奥林巴斯株式会社;1285 生物安全柜 美国热电公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的分离、纯化 从兰州浆水、新疆奶酪、玛曲酸奶、泽库酸奶、兰州腌菜、藏獒肠道内溶物等6种样品中,分别称取0.5 g加入到装有4.5 mL无菌水的试管中,逐次稀释至10-6,取10-4、10-5、10-6三管稀释液各0.1 mL,涂布于MRS固体培养基,37 ℃恒温培养48 h进行分离。挑取菌落,连续划线分离纯化,经镜检确认为纯种后,置4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 降胆固醇乳酸菌初筛 无菌条件下,于灭菌的MRS液体培养基中加入3%鸡蛋黄作为胆固醇源,无菌均匀分装到三角瓶中。以2%(菌体浓度为108cfu/mL)的接菌量加入菌液,37 ℃恒温培养24 h,在8000 r/min下离心10 min,取上清液测定其中胆固醇含量[19]。每组实验设定3个重复。

胆固醇降解率按照以下公式计算:

胆固醇降解率(%)=(C-A)×100/C

式中:A为菌株发酵后培养液在560 nm处的OD值;C为对照在560 nm处的OD值。

1.2.3 降胆固醇乳酸菌复筛 将初筛降解率较高的菌株以2%(菌体浓度为108cfu/mL)的接菌量接种于高胆固醇MRSO-CHOL培养基中,37 ℃恒温培养24 h,在8000 r/min下离心10 min,取上清液按照磷硫铁比色法[19],测定上清液中胆固醇含量,计算胆固醇降解率。

1.2.4 菌株对甘油三酯的降解 无菌条件下,于灭菌的MRS液体培养基中加入2%的甘油三酯标准品,无菌分装到三角瓶中。以2%(菌体浓度为108cfu/mL)的接菌量加入菌液(未接菌的试管作为空白对照),37 ℃恒温培养24 h,于420 nm处测定甘油三酯降解率[20]。

甘油三酯降解率(%)=(C-A)×100/C

式中:A为菌株发酵后培养液在420 nm处的OD值;C为空白对照在420 nm处的OD值。

1.2.5 菌株耐酸实验 将菌株活化后制成菌悬液(菌体浓度为108cfu/mL),将不同菌株分别接种于pH6.8、pH3.0、pH2.0的液体培养基中,37 ℃恒温培养10 h,利用梯度稀释平板法测定活菌数,做5个平行求平均值。以菌株名称为横坐标,单位菌落总数对数值为纵坐标绘图。

1.2.6 菌株对0.3%胆盐环境的耐受力测定 将菌株活化后制成菌悬液(菌体浓度为108cfu/mL),按2%的接种量分别接种于含0.0%(空白)、0.3%牛胆盐的复合液体培养基中。37 ℃培养24 h后,分别测定其OD值,做3个以上平行求平均值,按下述公式计算菌株对胆盐的耐受力。

胆盐耐受力(%)=含胆盐培养基的OD×100/空白培养基的OD

1.2.7 抑菌试验 取活化好的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种于营养肉汤中,37 ℃恒温培养24 h,用无菌水稀释至108cfu/mL,备用。活化待测菌株,采用牛津杯法进行抑菌试验[21],每个指示菌做两个平皿,测抑菌圈直径,求平均值,空白对照组采用无菌水进行实验。

1.2.8 小鼠体内毒性试验 将20只小鼠随机分成2组,A组灌胃生理盐水,B组灌胃3株乳酸菌混合菌悬液(1∶1∶1)。A组小鼠每只每天灌胃生理盐水0.5 mL,B组小鼠每只每天灌胃含1×108个乳酸菌的混合悬浮液0.5 mL。为了保证菌体溶液中一定的活菌数,每次灌胃都采用新鲜处理的菌株。自由进水,每周记录体重。在给药42 d后,处死解剖,将心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺取出用生理盐水冲洗并擦拭干净后称重,进行脏器指数的测定[22],观察脏器是否发生病变。

脏器指数(%)=脏器质量×100/体重

1.2.9 菌株生理生化及分子鉴定 分离菌株主要通过碳源利用试验、氮源利用试验、产酸试验、运动性检查等生理生化特征进行鉴定。采用16S rDNA法对所分纯的菌株进行分子鉴定。16S rDNA扩增及序列测定方法参照文献[23]。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)产物测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。测序完成提交菌株的16S rDNA序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,美国国立生物技术信息中心)数据库中进行比对,MEGA软件分析,采用Neighbor-Joining构建系统发育树,Bootstrap 1000次进行稳定性验证。

1.3 数据处理

本研究的数据为平均值±标准偏差(Mean±SD),采用Microsoft Excel 2007处理数据,应用SPSS 17.0统计分析数据,采用MEGA 5.0构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株分离、纯化结果

从采集的6种样品中共分离得到17株乳酸菌，见表1。分纯的17株乳酸菌菌落颜色均为乳白色,直径约2 mm,表面光滑、边缘整齐、中央隆起,菌落周围有明显的溶钙圈,乳酸菌镜检形态为短杆状、单球状、双球状和链球状。

表1 分纯乳酸菌来源及形态特征Table 1 Source and morphological characteristics of lactic acid bacteria

2.2 降胆固醇菌的初筛结果

对17株乳酸菌进行降胆固醇能力测试,结果发现,有11株乳酸菌具有降胆固醇能力,测定结果见图1所示。由图1可以看出,菌株ZL014、ZL016、ZL010、ZL011、ZL012、ZL013、ZL005对于蛋黄中胆固醇的降解率较高,其中菌株ZL010降解率最高,达到73.65%,后续实验选取不同来源菌株中降解率较高的ZL010(兰州浆水)、ZL016(藏獒肠道)、ZL005(玛曲酸奶)3株乳酸菌进行研究。

图1 不同乳酸菌菌株对蛋黄中胆固醇降解率的影响Fig.1 Effect of cholesterol degration rate in egg yolk of different lactic acid bacteria

2.3 降胆固醇菌的复筛结果

由图2可以看出,菌株ZL010对于高纯度胆固醇的降解率最高,为40.06%,其余相对较低。

图2 不同菌株对高纯度胆固醇降解率的影响Fig.2 Effect of cholesterol degradation rate of the strains

2.4 菌株对甘油三酯的降解效果

由图3可以看出,三株乳酸菌对于甘油三酯具有不同的降解能力,其中ZL010最高,降解率达到5.1%,其余两株降解率相对较低,ZL005为3.9%,ZL016为2.8%。

图3 菌株对甘油三酯的降解能力Fig.3 Triglyceride-lowering ability of strains

2.5 复筛后菌株的耐酸实验结果

在37 ℃恒温培养10 h后,3种菌都呈现了较强的耐酸性,3株菌在pH3.0的条件下存活率都比较高,pH2.0时,菌株的存活率与pH6.8时对比都有所下降,但仍能达到105cfu/mL(见图4)。胃中的酸环境随饮食结构不同而发生较大的变化。一般来说,空腹时胃液的pH为0.9～1.8,进食过程中pH为1.8～5.0,通常维持在3.0左右[24]。耐酸实验表明,菌株具备一定的耐受胃中酸性环境的能力。

图4 不同酸度对菌株生长的影响Fig.4 Effects of different acidity on the growth of strains

2.6 菌株对0.3%胆盐环境的耐受力测定结果

由图5可以看出,菌株ZL005在含0.3%牛胆盐的培养基中生长基本不受抑制,而菌株ZL010和ZL016在含0.3%牛胆盐的培养基中生长略受抑制,人体小肠中胆盐含量在0.03%～0.3%范围内波动,而试验所选取胆盐含量为最大浓度,在实际应用中将会有更多菌存活。

图5 胆盐耐受试验Fig.5 Tolerance of the strains to bile salts

2.7 抑菌试验结果

各菌株对指示菌的抑菌效果见表2所示,菌株ZL005、ZL010、ZL016对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有不同程度的抑制作用,其中ZL010对三种菌的抑制效果最显著,ZL016次之，ZL005抑菌效果略低。

表2 菌株对指示菌的抑制作用(直径，mm)Table 2 Inhibitory effect of the strains(diameter，mm)

2.8 毒性试验结果

毒性试验结果发现小鼠毛色光洁,食欲、两便正常,灌胃42 d未出现异常体征,未发现异常死亡,小鼠体重增长前14 d较快,14 d后趋于平稳(见图6)。小鼠处死解剖后,内脏正常,颜色红润、光滑,无器质性病变,小鼠脏器指数与对照组相比无显著差异(p>0.05),结果表明乳酸菌菌株对小鼠没有毒副作用(见表3)。

表3 毒性试验小鼠脏器指数比较(%)Table 3 Viscera indices of mice(%)

图6 小鼠体重变化Fig.6 Weight changes in mice

2.9 菌株生理生化鉴定结果

3株菌革兰氏染色均为阳性,经半固体培养基穿刺培养发现,菌株沿穿刺线生长,边缘清晰,无运动性,兼性厌氧。菌株均不还原硝酸盐,不液化明胶,接触酶和氧化酶反应均为阴性,3株菌具体生理生化鉴定结果见表4所示。

表4 3株乳酸菌生理生化鉴定结果Table 4 Physiological identification results

2.10 16S rDNA分子鉴定

测序完成提交菌株的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行比对,结果发现菌株ZL016的基因序列,与戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)的同源性为99.9%,使用Neighbor-Joining构建系统发育树,结果显示,菌株ZL016在系统发育树上与Lactobacilluspentosusstrain 124-2在一个分支上(图7),因此结合生理生化特征,鉴定菌株ZL016为戊糖乳杆菌。菌株ZL010的基因序列,与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的同源性为99.9%,在系统发育树上与Lactobacillusplantarumstrain JCM 1149在一个分支上(图8),因此结合生理生化特征,鉴定菌株ZL010为植物乳杆菌。菌株ZL005与耐久肠球菌(Enterococcusdurans)的同源性为100%,因此结合生理生化特征,鉴定菌株ZL005为耐久肠球菌(图9)。

图7 ZL016与相关菌株的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of ZL016 and related strains

图8 ZL010与相关菌株的系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree of ZL010 and related strains

图9 ZL005与相关菌株的系统发育树Fig.9 Phylogenetic tree of ZL005 and related strains注:发育树节点的数字表示Bootstrap值,括号中的数字为序列登录号,标尺代表进化距离单位。

3 结论

从6种西北特有样品中筛选分离出3株具有降胆固醇降甘油三酯能力的乳酸菌,其中菌株ZL010降胆固醇降甘油三酯效果最强,蛋黄中胆固醇的降解率为73.65%,高纯度胆固醇降解率为40.06%,甘油三酯降解率为5.1%。3株菌都具有很好的抑菌、耐酸、耐胆盐能力,菌株经生理生化及16S rDNA鉴定为:ZL005为耐久肠球菌(Enterococcusdurans),ZL010为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum),ZL016为戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)。经动物体内毒性实验发现,小鼠未出现异常体征,未发现异常死亡,且解剖观察各脏器一切正常,无任何病变,证明菌株无毒副作用。因此,菌株可用于降脂降胆固醇保健药品及功能食品的制备。