生姜与醋泡姜抗氧化、抑菌和抗肿瘤活性比较研究

田程飘,朱伟伟,宋雅玲,牛思琪,申利群,2,*,吴爱群,*

(1.广西民族大学化学化工学院,广西南宁 530006;2.广西林产化学与工程重点实验室,广西南宁 530006)

生姜(ZingiberofficinaleRose)是姜科属多年生单子叶草本植物的根茎,作为特产经济作物在我国的中部、东南部至西南各省广为栽培,数千年以来一直被广泛用于日常生活中,并且在传统医学中也被大量使用了几百年[1]。近年来,由于具有众多重要的药理作用,生姜受到食品和制药行业的关注日益增加。生姜中所含的多种活性成分如黄酮类、姜黄素、姜辣素等具有开胃健脾、抗氧化、杀菌、抑制肿瘤等多种活性[2]。在民间,人们常采用醋泡的方法对生姜进行炮制后食用,口感更为美味可口[3]。根据中医理论,醋泡姜具有保护胃、抗炎、暖肺等功效,可减少水痰,控制呕吐,抗酸,抑菌[4-5],它可用于治疗感冒、减肥。养肝也是醋泡姜的重要作用之一,中医讲究五味配五脏,酸配肝,醋[6]就是一种酸性食材,它有养肝补肝的作用,而生姜性热,它能温补肝阳,平时人们食用醋泡姜时,酸辣适中,对食管和胃没有什么明显伤害,且可以提高肝功能。诸多的保健作用和极佳口感使得醋泡生姜已作为一种倍受认可的功能食品广为流传。目前对生姜的研究报道很多,但对醋泡后的生姜研究甚少[3],关洪全等[4]研究生姜与醋酸协同抗菌作用,发现生姜与较低浓度的醋酸组合后,对抗菌活性表现出一定的协同作用。

为更好地开发利用醋泡生姜这一功能食品。本研究测定醋泡生姜提取物的DPPH自由基、ABTS+自由基、羟基自由基(·OH)清除率及总还原力,对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和白色念珠菌的抗菌活性以及对人结肠癌细胞、人肝癌细胞、卵巢癌细胞的抗肿瘤活性,为进一步研究利用生姜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

姜的鲜根茎 广西南宁市罗文市场;75%乙醇、无水乙醇 国药集团;冰乙酸 成都科隆;抗坏血酸(VC)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等 均为国产分析纯;细菌培养基、真菌培养基、DMEM培养基、1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶EDTA消化液、磷酸盐缓冲液 生化试剂;供试真菌和细菌 北纳创联生物技术有限公司;人结肠癌细胞(human colon cancer cell,HCT116) 上海中乔新舟生物科技有限公司;人肝癌细胞(human liver cancer cell,HepG2) 温州医科大学;卵巢癌细胞(ovarian carcinoma cells,Skov3) 广西医科大学。

GO全波长酶标仪 Thermo Multiskan Go(Thermo Lab systems公司);生化培养箱 江苏华安设备有限公司;YXQ-100SII立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;CKX41倒置显微镜 日本Olympus公司;KA-1000低速离心机 上海安亭科学仪器厂;3111 5% CO2及饱和湿度孵化箱 美国Thermo Fisher scientific公司;SW-CJ-1F超净台 江苏苏净;96孔培养板 苏州海狸。

1.2 供试样品的制备

取新鲜生姜洗净,晾干表面水分,切成薄片(厚度为0.2～0.4 cm)[7],称取500 g,参考市售食醋含乙酸约为3%,用350 mL 3%冰乙酸刚好没过生姜进行醋泡,室温25 ℃下密封放置7d。滤出生姜放入磨口圆底烧瓶中,加蒸馏水至没过生姜,用挥发油提取装置,进行6 h的水蒸汽蒸馏提取得到挥发油。滤去水后加入75%乙醇[8-10]300 mL,85 ℃水浴回流1 h,减压回收滤液后得到醋泡生姜乙醇提取浸膏。另未醋泡的生姜进行同样提取,得生姜挥发油和生姜乙醇提取浸膏。

1.3 指标测定方法

1.3.1 抗氧化活性测定

1.3.1.1 对DPPH自由基清除能力的测定 参照文献[11],稍作修改,即配制系列浓度各样品溶液(生姜油和醋泡姜姜油0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL,生姜乙醇提取物和醋泡姜乙醇提取物0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0 mg/mL,抗坏血酸0.005、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050 mg/mL),1 mmol/L DPPH乙醇溶液。取96孔板,每孔加入150 μL DPPH乙醇溶液和样品溶液50 μL,振荡混匀后,室温避光放置30 min,于517 nm波长处测定吸光度,记为A1;以150 μL无水乙醇代替DPPH,同法测定吸光度,记为A2,以样品溶剂代替样品,同法测定吸光度,记为A0。以抗坏血酸溶液作为阳性对照,测定DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

1.3.1.2 ABTS+自由基清除能力的测定 参照文献[12],稍作改变,配制系列浓度各样品溶液(生姜油和醋泡姜姜油0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL,生姜乙醇提取物和醋泡姜乙醇提取物0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.50 mg/mL,抗坏血酸0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040 mg/mL),取7 mmol/L的ABTS+与1.4 mmol/L的过硫酸钾溶液等体积混合均匀,避光放置16 h,临用前用蒸馏水稀释至吸光度为0.7±0.02,得ABTS工作液。取工作液150 μL、样品溶液50 μL,置于96孔板孔中,反应6 min后于734 nm波长处测定吸光度,记为A1;以溶剂代替样品,同法测定吸光度,记为A0;以150 μL去离子水代替ABTS,同法测得各样品对照组的吸光度,记为A2。以抗坏血酸为阳性对照品,测定ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

1.3.1.3 对羟自由基(·OH)清除能力的测定 利用Fenton反应[13-14],在100 μL 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液中依次加入100 μL 9 mmol/mL 硫酸亚铁和1 mg/mL的样品提取物或0.2 mg/mL的抗坏血酸溶液(100、200、300、400、500、600和700 μL,生姜各样品在体系中浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL,抗坏血酸0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL),接着补充去离子水至1.4 mL,最后加入100 μL 8 mmol/L的H2O2启动反应,37 ℃水浴反应15 min后于510 nm处测吸光度A1,以去离子水替代样品同法测得A0,以去离子水代替H2O2测得各样品的对照A2。以抗坏血酸为对照,测定羟自由基(·OH)清除率。

·OH清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

1.3.1.4 还原能力的测定 配制系列样品溶液生姜油和醋泡姜姜油0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL,生姜乙醇提取物和醋泡生姜乙醇提取物0.03、0.05、0.10、0.30、0.50、1.00 mg/mL,抗坏血酸0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL),参照文献[15]配制各反应试剂,在EP管中加入500 μL pH=6.6的磷酸盐缓冲溶液,200 μL样品溶液,500 μL 1%铁氰化钾立刻混匀后于50 ℃反应20 min,取出加入500 μL 10%三氯乙酸,混匀反应10 min,取出500 μL,加入500 μL H2O,100 μL 0.1%三氯化铁溶液,静置10 min,于700 nm波长处测定吸光度。以抗坏血酸为阳性对照品,测定各吸光度,用于表示还原能力的强度。

1.3.2 抑菌活性的测定 通过采用微量肉汤稀释法来测定生姜提取物的最低抑菌浓度(MIC)[16]。采用微量二倍稀释法,在聚乙烯96孔板上进行:96孔板上每两行作为一个样品的平行试验,从A1开始为第一孔,从左到右,从上到下;每个板上1～11孔为样品,第12孔为培养基空白对照,每板留三孔加培养基和供试菌各100 μL作为验证,每个板只能加一种菌;大肠杆菌(G-),金黄色葡萄球菌(G+),枯草芽孢杆菌(G+)用LA肉汤培养基,肺炎克雷伯氏菌(G-)用MHA培养基,白色念珠菌用PDA培养基。用微量加液器加液,第2～11孔每孔加含2% DMSO的无菌培养基100 μL,往1号孔和2号孔中加入100 μL已配好的母液,依次对第1～11孔做梯度稀释。在每孔中加入100 μL的检验菌菌液,每孔菌数为5×104个。在1～11孔的样品最终浓度分别生姜乙醇提物和醋泡姜乙醇提物:1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.9063、1.9531和0.9766 μg/mL;生姜油和醋泡姜姜油:5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77和4.89 μg/mL。检验菌为金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌等的置于37 ℃培养24 h,白色念珠菌的放30℃。培养结束后,比较检测组与空白对照组浑浊度差异,无可见细菌生长即液体相对澄清且无沉淀的孔内所含的药物浓度即为最低抑菌浓度(MIC值)。

1.3.3 抗肿瘤活性测定 将冻存的HCT116、HepG2和Skov3细胞取出在38 ℃水浴加热,1 min内使其完全融化,加入到培养基混匀离心弃去上清液,加入适量培养基后接种于细胞瓶置37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱培养。传代培养细胞生长到对数期后用含10%胎牛血清的培养液重悬细胞,细胞密度控制在1×105个·mL-1左右细胞悬液,以每孔1×104个细胞的密度接种于96孔培养板,每孔100 μL。置37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱培养24 h,观察细胞大概长满96孔板的80%～90%即可上药。处理细胞:按试验设计共分4组,分别为生姜油、醋泡姜油、生姜乙醇提取物和醋泡姜乙醇提取物用药组。吸去孔内培养基后用药组加入浓度为200、100、50、25、12.5 μg·mL-1的各提取物溶液;同时设定调零孔,每组5个复孔,继续培养48 h。呈色:培养48 h后取出培养板,吸去上清液,每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg·mL-1),37 ℃继续培养4 h后,小心吸去孔内的培养上清液。每孔再加入100 μL二甲亚砜(DMSO),振荡10 min,使结晶物充分溶解。比色:选择490 nm波长,在自动酶标仪上测定各孔吸光度(A)值。细胞抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100,其中,As:实验孔,含有细胞的培养基,MTT,药物;Ac:对照孔,含有细胞的培养基,MTT,没有加药的培养基;Ab:空白孔,不含细胞和药物的培养基,MTT[17]。

1.4 数据处理

各实验均重复进行3次。抗氧化实验数据用Excel 2010软件计算平均值和标准差,Origin Pro 9作图,计算IC50;抗肿瘤实验数据表示为Mean±SD,采用Graphpad prism 6.0软件计算出IC50值,用Excel 2010软件计算平均值和标准差。

2 结果与分析

2.1 抗氧化活性测定结果

2.1.1 姜提取物对DPPH自由基的清除作用 由图1可看出生姜油和醋泡姜姜油对DPPH自由基的清除率在0.4～6 mg/mL的范围内与浓度成正相关。随样品浓度的增加,生姜油对DPPH自由基的清除率由19.89%上升至59.68%,醋泡姜姜油对DPPH自由基的清除率由20%上升至56.24%,两者相差不大(IC50分别为4.67和4.9 mg/mL)。生姜乙醇提取物在0.1～0.8 mg/mL的范围内随浓度的增加,清除率由35.8%上升至52%,而后趋于平缓而不变,IC50为0.67 mg/mL,与夏树林等[18]的研究结果相符(IC50为0.8 mg/mL,且高于此浓度后,清除率趋于平缓),弱于唐仕荣等[19]的研究的研究结果(IC50为0.076 mg/mL);醋泡姜乙醇提取物在0.1～2 mg/mL之间随浓度的增加,对DPPH自由基的清除率为增强趋势,清除率由27.41%上升至60.12%,随后亦趋于平缓,IC50为1.25 mg/mL;最终在2、4 mg/mL浓度下醋泡姜乙醇提取物较生姜乙醇提取物清除DPPH自由基效果均好一些。而抗坏血酸在0.005～0.05 mg/mL的范围内,清除率由24.24%上升至83%,IC50为0.018 mg/mL。综上,对于清除DPPH自由基活性的效果,抗坏血酸≫生姜乙醇提取物>醋泡姜乙醇提取物>生姜油≈醋泡姜姜油。

图1 样品浓度对DPPH自由基清除效果的影响Fig.1 Effects of samples concentrations on DPPH free radical scavenging ability

2.1.2 姜提取物对ABTS+自由基的清除作用 由图2所示,随着样品浓度的增加,其对ABTS+自由基的清除率均呈上升趋势,清除率与样品浓度成正相关。其中,生姜油在0.05～1 mg/mL的范围内随浓度的增加,对ABTS+自由基的清除率由10.38%上升至70.08%;而醋泡姜姜油的清除率则由14.07%上升至71.179%。比较得出醋泡姜姜油(IC50为0.52 mg/mL)对ABTS+自由基的清除能力略强于生姜油(IC50为0.59 mg/mL)。生姜乙醇提取物在0.05～0.25 mg/mL之间随浓度的增加,对ABTS+自由基的清除率明显增强,清除率由34.78%上升至90.16%,而后变缓,最终为90.81%;醋泡姜乙醇提取物在0.05～0.25 mg/mL之间随浓度的增加,对ABTS+自由基的清除率明显增强。清除率由34.66%上升至88.19%,而后变缓,最终为90.62%;两个乙醇提取物对ABTS+自由基的清除能力差异不明显(IC50分别为0.07和0.08 mg/mL)。综合得出,四种提取物清除ABTS+自由基能力:抗坏血酸>生姜乙醇提取物≈醋泡姜乙醇提取物>醋泡姜姜油>生姜油。

图2 样品浓度对ABTS+自由基清除效果的影响Fig.2 Effects of samples concentrations on ABTS+ free radical scavenging ability

2.1.3 姜提取物对羟自由基(·OH)的清除作用 由图3可知,醋泡姜姜油对羟自由基(·OH)的清除作用明显优于生姜油,在0.1～0.7 mg/mL的浓度范围内,清除率由23.76%上升至92.2%,IC50为0.28 mg/mL,而生姜油在相同的最大浓度下仅是达到81.67%,且其IC50为0.42 mg/mL,弱于醋泡姜姜油。两个乙醇提取物的清除作用较弱,在相同浓度下,生姜乙醇提取物的清除率由13.81%上升至54.7%;醋泡姜乙醇提取物的清除率则由15.04%上升至50.58%,上升趋势较缓慢;比较得出两个乙醇提取物清除羟自由基(·OH)效果相差不显著(IC50分别为0.65和0.69 mg/mL)。抗坏血酸在0.02～0.14 mg/mL的浓度范围内,清除率由14.36%上升至100%,IC50为0.07 mg/mL。综上可知,对于羟自由基(·OH)的清除作用抗坏血酸>醋泡姜姜油>生姜油>生姜乙醇提取物≈醋泡姜乙醇提取物。

图3 样品浓度对羟自由基(·OH)清除效果的影响Fig.3 Effects of samples concentrations on hydroxyl free radical scavenging ability

2.1.4 姜提取物还原力的测定 由图4可知,在一定浓度范围内,随样品浓度的升高,总还原力呈上升趋势。其中,生姜油在0.8～6 mg/mL的范围内,吸光度由0.129上升至0.327;在相同浓度下,醋泡姜姜油吸光度由0.128上升至0.391;由此得出,一定浓度范围内,醋泡姜姜油的还原力强度优于生姜油。生姜乙醇提取物总还原力在0.03～1 mg/mL的范围内与浓度成正相关,但0.03～0.3 mg/mL变化较缓,0.5～1 mg/mL急剧上升,吸光度由0.121上升至0.204,1 mg/mL时为0.421;醋泡姜姜乙醇提取物在0.03～1 mg/mL浓度区间内,吸光度由0.117上升至0.447。综上可知,醋姜油和醋姜乙醇提取物还原力的强度优于生姜油与生姜乙醇提取物,但均差于抗坏血酸。

图4 样品浓度对总还原力的影响Fig.4 Effects of samples concentrations on total reducing power

2.2 姜提取物对各供试菌的MIC

生姜提取物对各供试菌的最低抑菌浓度见表1～表4。由此可知,生姜提取物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和肺炎克雷伯氏菌抑菌浓度各不相同,最低抑菌浓度(MIC)分别为156.25、500、250 μg/mL。随着提取物浓度的增加,其抑菌活性也逐渐增强。四种样品中,对金黄色葡萄球菌抑制效果最好的是醋泡姜姜油,MIC为156.25 μg/mL,而乙醇提取物的均为1000 μg/mL,对枯草芽孢杆菌和肺炎克雷伯氏菌抑制效果最好的为生姜乙醇提取物和醋泡姜乙醇提取物,MIC分别为500和250 μg/mL,高于李钟美[20]的研究结果,可能是其所用样品为溶剂提取混合物,而本研究的提取分成了挥发油和树脂两部分。可见生姜提取物与醋泡姜提取物均具有一定的抑菌作用。醋泡姜姜油对金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的抑制作用均优于生姜油,推测醋酸作用于生姜对抑菌效果起到了一定的协同作用,即醋泡可在一定程度上增强生姜的抑菌效果。

表1 生姜油对不同细菌生长的抑制情况Table1 Inhibition of growth of different bacteria by ginger oil

表2 醋泡姜姜油对不同细菌生长的抑制情况Table 2 Inhibition of growth of different bacteria by vinegar ginger oil

表3 生姜乙醇提取物对不同细菌生长的抑制情况Table 3 Inhibition of growth of different bacteria by ginger ethanol extract

表4 醋泡姜乙醇提取物对不同细菌生长的抑制情况Table 4 Inhibition of growth of different bacteria by vinegar ethanol extract

2.3 MTT法检测出姜提取物对肿瘤细胞的增殖抑制作用

采用MTT法检测四个姜提取物对HCT116、HepG2和Skov3三种人肿瘤细胞的增殖抑制作用,结果如表5所示,各个姜提取物对HCT116、HepG2和Skov3都有一定的增殖抑制作用。作用24 h时,观察到抑制作用仍不明显,孔内液体仍带培养基原来的浅紫色,说明用药组尚未开始起作用,推测可能是样品为混合物,其主要抗肿瘤成分含量相对较少的原因。作用48h后呈色,96孔板上颜色呈梯度,药物浓度越大的颜色越浅,原因是药物浓度大抑制作用强,存活细胞少,其代谢物少而与MTT呈色浅。其中在HCT116的增殖抑制作用实验中,生姜乙醇提取物的效果最为突出[(49.4±1.42) μg/mL],Gan等[21]在研究人结肠癌细胞HCT116中发现,6-姜烯酚透过下调细胞周期蛋白cyclinB、cdc25C、cdkl和纺锤体装配蛋白cdc20、mad2和survivin的表达,造成G2/M期周期阻滞的不可逆转,促使细胞死亡;姜油、醋泡姜姜油、生姜乙醇提取物、醋泡姜乙醇提取物四个样品对Skov3的抑制效果较好,其IC50分别为(38.37±0.66)、(39.90±1.37)、(48.18±1.3)和(48.79±1.24) μg/mL。即醋泡生姜和生姜对卵巢癌(Skov3)细胞有一定的抑制作用。

表5 四种姜提取物对HCT116、HepG2和Skov3的IC50(μg/mL)Table 5 IC50 of four ginger extracts to HCT116,HepG2 and Skov3 cells(μg/mL)

3 结论

本研究比较分析了生姜与醋泡姜的抗氧化、抑菌与抗肿瘤活性其中,醋泡姜姜油的清除ABTS+自由基、羟自由基(·OH)能力和还原能力均强于生姜油,生姜乙醇提取物与醋泡姜乙醇提取物抗氧化能力相差不显著,总体上其乙醇提取物的抗氧化效果稍优于其挥发油。

在微量肉汤稀释法评价四个生姜提取物的抑菌实验中,抑菌效果最佳的是醋泡姜姜油,其对金黄色葡萄球菌的MIC为156.25 μg/mL,其次是两个乙醇提取物对枯草芽孢杆菌和肺炎克雷伯氏菌抑制效果,MIC分别为500和250 μg/mL;实验表明四个生姜样品均具有较强的抑菌效果,醋泡姜姜油对金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的增殖抑制作用均明显强于生姜油,推测是醋泡对生姜抑菌成分产生了影响。在MTT法测定生姜提取物对HCT116、HepG2和Skov3三个肿瘤细胞的试验中,四个姜提取物均体现出一定的增殖抑制作用,以生姜乙醇提取物对HCT116的增殖抑制作用最为突出[(49.4±1.42) μg/mL],四种姜提取物对Skov3均有良好的抑制效果,此结果可以为醋泡生姜的研究开发提供一定的参考。