大豆异黄酮对萨能种公羊精液常温保存效果的影响

文/邵钺馨 钟玉玲 李仲阳 史怀平

（西北农林科技大学动物科技学院）

萨能奶山羊是世界上优秀的奶山羊品种之一，多作为奶山羊品种改良的父本。人们对羊奶需求量的增长，促使我国羊奶产业迅猛发展。截至2016年底，仅陕西省奶山羊存栏量就达到220 万只[1]。随着选种、选育技术的不断发展，萨能奶山羊的精液品质成为配种工作中一项重要指标，精液的保存和稀释在很大程度上影响精液品质。近年来，有关抗氧化剂对冻精保存效果的研究较多。霍敏（2018） 研究表明，在绒山羊精液稀释液中添加0.5 mg/mL的褪黑素，较对照组的精子活率提高8.5%，顶体完整率提高24.73%[2]。王艳华（2016）研究发现，在冷冻稀释液中添加1.0 mg/mL的番茄红素解冻后，精子活率为52.04%，在稀释液中添加10 μg/mL的α-硫辛酸，精子活率为50.71%，添加抗氧化剂的试验组较对照组能够显著提高精液品质[3]。

本试验采用的大豆异黄酮从豆科植物中提取，具有抑制脂质过氧化反应，增强机体抗氧化能力作用，其分子结构上含有多个酚羟基，可以与自由基结合，达到消除自由基的功效，已广泛应用于畜牧业生产中。研究表明，大豆异黄酮不仅能够增加动物的采食量[4]，对机体的繁育性能也有积极影响。郭振慧等（2016） 研究表明，在公兔日粮中添加6 mg/kg大豆异黄酮，可以提高公兔抗热应激能力，缓解热应激造成的睾丸损伤[5]。范觉鑫等（2012）研究表明，在香猪日粮中添加250 mg/kg大豆异黄酮能够促睾丸的生长发育，睾丸组织中α-葡萄糖苷酶含量较对照组增加137.99 U/L[6]。但目前，在萨能种公羊精液稀释液中添加大豆异黄酮对精液品质的影响鲜有报道。因此，本试验旨在探究在种公羊精液稀释液中外源添加大豆异黄酮对精液常温保存的影响，为大豆异黄酮在精液保存的实际应用提供参考依据。

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．1．1 试验精液

所用精液来源于西北农林科技大学畜禽生态试验站萨能羊原种场的成年萨能种公羊。

1．1．2 主要试剂

三羟甲基-氨基甲烷（Tris）、柠檬酸、葡萄糖、果糖、海藻糖、维生素C（Vc）、还原型谷胱甘肽（GSH）、牛血清白蛋白（BSA）、三磷酸腺苷（ATP）、甘油、抗生素。

1．1．3 仪器设备

分析天平、微量移液器、电磁搅拌器、恒温箱、高压灭菌锅、显微镜等。

1．2 试验准备

1．2．1 稀释液配方

利用本实验室发明专利（常温稀释液“奶山羊精液常温及低温保存稀释液”；专利号码：ZL201310529785.7），主要成分包括：Tris 300 mmol/L，柠檬酸94.7 mmol/L，果糖30 mmol/L，海藻糖225 mmol/L，Vc 5 g/L，GSH 5 mmol/L，BSA 3 g/L，ATP 1.2 mmol/L，复合抗生素。

1．2．2 静液采集

采精一般在早上8:00—10:00进行，采精前选择发情状况良好的母羊作为台羊，选用假阴道法对试验种公羊进行采精，采集后及时检测并记录采精量及精液pH值，然后4 倍稀释做好标签放入37 ℃保温杯中，整个采精过程保证保温杯水温稳定在37 ℃，采精完成后于30 min内将精液带回实验室检测品质指标。

1．2．3 精液稀释

按照试验设计分为3 组，每组稀释液中大豆异黄酮浓度分别为0 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L。取1 mL稀释液于5 mL离心管中，置入恒温水浴锅至37 ℃，与0.3 mL等温的鲜精缓慢混匀，用纱布包裹放入17 ℃恒温箱，每12 h轻轻翻动1 次防止精子沉积，每组设计5个重复。

1．3 精液保存效果检测

1．3．1 有效存活时间

精液保存在17 ℃恒温箱中，每12 h检测1 次活力指标，当精子活率低于0.6时默认为输精效果较差，记录精子活率低于0.6的保存时间。

1．3．2 精子活率

精子活率的测定参照胡传水[7]对猪精液的计数方法。

1．3．3 精子质膜和顶体完整性

质膜完整性：使用试剂盒进行低渗肿胀试验（Hypoosmotic Swelling Test，HOST），质膜完整的精子会吸水膨胀产生弯尾现象，质膜不完整的精子形态不会发生变化，400 倍显微镜下统计弯尾率，计数至少200 个精子，每个样品重复3 次。

顶体完整性：依照精子快速染色试剂盒方法，制作涂片并完成染色，置于油镜下观察，顶体完整的精子可以观察到明显的透明带结构，计数至少200 个精子，每个样品重复3 次。

1．3．4 精子T-AOC、MDA、ROS水平检测

总抗氧化能力（T-AOC）、氧化应激产物丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量采用购自南京建成生物工程研究所的检测试剂盒进行测定。

1．4 数据分析

运用GraphPad Prism 5.0对试验数据进行单因素方差分析，最终试验结果表示为“平均数（x）±标准差（s）”。

图 1 大豆异黄酮浓度对成年公羊精子有效存活时间的影响

2 结果与分析

2．1 大豆异黄酮对精液常温保存效果的影响

由图1可知，基础稀释液中添加大豆异黄酮至浓度为0.05 mmol/L时，精子有效存活时间为（31.42±2.97）h，较对照组存活时间增加12.89 %，但差异不显著（P＞0.05）。基础稀释液中添加大豆异黄酮至浓度为0.10 mmol/L时，精子有效存活时间为（30.6±4.29）h，与0.05 mmol/L大豆异黄酮组和对照组差异不显著（P＞0.05）。

表 1 在常温保存条件下添加大豆异黄酮对成年公羊精子活率的影响

表 2 常温保存条件下添加大豆异黄酮对成年公羊精子结构完整性的影响

2．2 大豆异黄酮对精子活率的影响

由表1可知，试验组与对照组在精子保存前2 天时，精子活率差异不显著（P＞0.05）。精子保存第3～4天时，0.05 mmol/L大豆异黄酮组的精子活率与对照组和0.10 mmol/L大豆异黄酮差异不显著（P＞0.05）；0.10 mmol/L大豆异黄酮组的精子活率与对照组差异性显著（P＜0.05）。在第5天，大豆异黄酮组的精子活率均显著高于对照组（P＜0.05）。

2．3 大豆异黄酮对精子结构完整性的影响

由表2可知，精液保存第3天时，0.10 mmol/L大豆异黄酮组的质膜完整性显著高于对照组，提高了2.51 个百分点（P＜0.05）；在第4天后，试验组的质膜完整性均显著高于对照组，0.10 mmol/L大豆异黄酮组提高了3.29 个百分点（P＜0.05）。精液保存期间，大豆异黄酮组的顶体完整性与对照组差异不显著（P＞0.05）。

2．4 大豆异黄酮对精液抗氧化指标的影响

精液放于17 ℃恒温箱的第3天，检测精液的抗氧化指标。随着大豆异黄酮浓度的增加，精液的抗氧化能力增强。由图2可知，大豆异黄酮组T-AOC水平显著高于对照组（P＜0.05）。精液中MDA水平与大豆异黄酮浓度成反比，各组间MDA水平差异显著，0.10 mmol/L大豆异黄酮组低于0.05 mmol/L大豆异黄酮组，0.05 mmol/L大豆异黄酮组低于对照组（P＜0.05）。大豆异黄酮组ROS水平显著低于对照组，但2 个大豆异黄酮组间差异性不显著（P＞0.05）。

3 讨论

精子在常温环境下活动性强，易产生氧化损伤。因此，外源添加抗氧化剂成为精液稀释液保存的研发重点。研究表明，多种不饱和脂肪酸和蛋白质位于精子质膜上，质膜完整性在精子获能及顶体反应中有重要作用。精子顶体内膜存在大量顶体酶原，酶原能够促使精卵结合，顶体的完整性决定了进行精卵结合的能力。同时，延长精液常温保存时间为跨区域引种提供保障，提高精液在人工授精过程中的有效利用率。大豆异黄酮是一种植物性雌激素，高剂量添加于稀释液中不易溶解，导致关于其对精液保存效果报道较少，降低了大豆异黄酮在动物保种工作中的实际应用价值。本试验在精液稀释液中添加不同浓度的大豆异黄酮，分析精液常规指标和抗氧化指标，发现其能够降低精液在常温保存过程中所受的损伤，改善精液品质。

图 2 大豆异黄酮对成年奶山羊精液抗氧化水平的影响

3．1 大豆异黄酮对精液常温常规指标的影响

目前，关于抗氧化剂对家畜精液保存影响的报道不一。刘琦等（2015）在常温保存基础稀释液中添加不同体积的GSH，每隔24 h观察精子活力，结果表明1 mmol/L和5 mmol/L GSH常温有效存活时间达到5 天，显著高于对照组保存时间[8]。何锦等（2015）在猪精液常温保存稀释液添加10 mol/L五味子乙素，精液在第5天仍可进行人工输精要求[9]。徐文慧等（2017）探究抗氧化剂对马精液低温保存效果发现，添加牛磺酸冷冻保存2 天后，精子活率为78%[10]。任子利等（2016）研究发现，外源添加5.0 g/L维生素C试验组与对照组藏猪精子畸形率差异性显著，畸形率降低10 %，精子活率为69%[11]。有研究表明，不同稀释液对种公羊精液保存时间有差异[12]。本试验在羊精液稀释液中添加大豆异黄酮至浓度为0.05 mmol/L、0.10 mmol/L时，试验组的精液保存时间均高于对照组，但组间差异不显著。试验第2天，精子活率低于0.6，但0.10 mmol/L大豆异黄酮组的精子活率下降趋势平缓。精液保存至第3～4天时，0.10 mmol/L大豆异黄酮组的精子活率显著高于对照组，说明大豆异黄酮对精子活率有保护作用，能够有效缓解精子在常温保存过程中活率下降的现象。与其他试验结果不同的是，萨能奶山羊精液存活时间明显较短，分析原因可能是：其一，试验动物不同，羊的精子遗传特性与生理学特征可能有其特殊性；其二，抗氧化剂不同，大豆异黄酮不同于其它抗氧化剂，可能对精液抗氧化效果影响小，而且有可能存在奶山羊精液对大豆异黄酮不敏感的因素。此外，还可能与添加大豆异黄酮的浓度有关，在后续试验中应进行0.25 mmol/L、0.50 mmol/L水平对精液的影响。

精液在保存过程中，会受到温度、pH值、渗透压等影响，造成精子结构完整性被破坏。毛冉等（2016） 研究发现，每100 mL杜泊羊精液稀释液中添加5 mL卵黄保存，与对照组的顶体完整性和质膜完整性相比差异性显著，随着卵黄添加量的增多，保存效果越明显，保存72 h时检测发现，添加15 mL卵黄的稀释液可使精子质膜完整性达到35%以上，顶体完整性达到68.3%左右[13]。李方舟等（2018）研究发现，在稀释液添加20 mg/L褪黑素对萨福克公羊精液低温保存，第3 天时质膜完整率高出对照组5.98%，顶体完整率比对照组高4.15%[14]。本试验研究发现，精液保存第3天时，0.10 mmol/L大豆异黄酮组比对照组的质膜完整性高出2.51%。虽然试验结果显示，顶体完整性与对照组差异性不显著，但是可以看出在稀释液中添加大豆异黄酮对精子结构完整性有促进效果。

3．2 大豆异黄酮对精液抗氧化指标的影响

精液中T-AOC水平高低，能够反应抗氧化剂结合活化氧自由基能力；MDA水平是脂质过氧化程度的体现[15]；ROS的水平代表活化氧的含量，其产生过程复杂，ROS含量的增多会破坏机体的抗氧化系统。本试验中，0.10 mmol/L大豆异黄酮组的T-AOC水平显著增强，其余氧化指标与对照组差异性显著，0.10 mmol/L大豆异黄酮组与对照组相比，精液的T-AOC水平提高48.25%、MDA水平下降47.93%。Naijian等（2013）试验表明，添加1 mmol/L抗氧化丁基甲苯不能影响精子顶体完整性，但能极显著降低MDA水平，改善山羊精子活率[16]。Khalifa等（2010）研究证明，添加0.6 mmol/L抗氧化丁基甲苯能够维持解冻后50%左右的精子活率和较高的繁殖率[17]。Li等（2017）研究表明，保存杜洛克公猪精液时，添加5 mmol/L牛磺酸能够维持T-AOC水平，降低脂质过氧化物水平，延长精液保存时间[18]。这与本试验获得的精液保存效果类似，精液在保存过程中抗氧化能力降低，外源添加适量大豆异黄酮能够增强精子抗氧化酶活性，从而提升T-AOC水平，降低MDA和ROS水平，达到精液长时间保存的效果。

4 结论

在萨能种公羊精液常温保存过程中，稀释液中添加大豆异黄酮浓度至0.10 mmol/L时，可有效提高精子活率，保护精子结构完整性，而且可显著提高精液抗氧化水平，对精液常温保存具有一定的积极作用。