卵巢早衰患者来源特异干细胞分化为单倍体细胞的研究

吕杰 韩婵琳 何文 蔡柳洪

【关键词】 卵巢早衰;诱导多能干细胞;减数分裂;卵子

Study of differentiation of premature ovarian failure patients-specific induced pluripotent stem cells into haploid cells Lyu Jie， Han Chanlin， He Wen， Cai Liuhong. Department of Reproductive Center， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Cai Liuhong， E-mail： cailh@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】 Objective To explore the possibility of premature ovarian failure patients specific-induced pluripotent stem cells （POF-iPSCs） differentiating into haploid cells.  Methods The monocytes in the peripheral blood of POF patients were nuclear stained and reprogrammed into iPSCs to establish POF-iPSCs， and subsequently cultured with activin A and glycogen synthase kinase-3 （GSK-3） inhibitor （CHIR-99021） for 2 d， supplemented with bone morphogenetic protein 4 （BMP 4） and epidermal growth factor （EGF） for 5 d， and retinoic acid （RA） for 7 d. The baseline （D0）， 7 d-culture （D7） and 14 d-culture （D14） and control groups were established. qPCR and immunofluorescent staining were performed to detect the expression levels of mRNA and protein of primordial germ cells and the meiosis-related genes. FISH was adopted to detect the intracellular X chromosome segregation. Flow cytometry was conducted used to determine the proportion of haploid cells.  Results During the induction process of POF-iPSCs， the fusiform fiber-like cells were observed in the D0 group， the cell body was enlarged with thin cytoplasm and multiple antennae in the D7 group， and the cell nucleus and nucleolus became evident in the D14 group. The relative expression level of NANOG mRNA was down-regulated， whereas that of BLIMP1 was gradually up-regulated along the differentiation. STELLA， OCT4， DDX4， γH2AX and MLH1 mRNA levels were the highest in the D7 group， and DAZL， SYCP3 and PRDM9 mRNA levels were gradually up-regulated from the D7 to D14 groups （all P < 0.01）. DAZL， PRDM9 and SCP3 proteins were not expressed in the D0 group. DAZL and PRDM9 proteins were positively expressed in the D7 group. DAZL， PRDM9 and SCP3 proteins were expressed in the D14 group. FISH demonstrated that no X chromosome segregation was detected in the control group. X chromosome segregation was observed in partial cell nucleus in the D14 group， prompting the possibility of haploid cells. The chromosomes during meiosis were observed in all groups. In the D14 group， the proportion of haploid cells was significantly higher compared with those in the remaining three groups （all P < 0.01）. Conclusion POF-iPSCs can differentiate into primordial germ cells after in vitro culture. Some cells can complete meiosis and differentiate into haploid cells.

【Key words】 Premature ovarian failure;Induced pluripotent stem cells;Meiosis;Oocyte

卵巢早衰在生育年龄的妇女中发病率为1% ～ 3%，缺乏发育成熟的卵子是卵巢早衰患者解决生育需求的最大困境[1]。卵巢异体移植已经有成功的案例报道，但移植物的稀缺及伦理问题无法解决[2]。来源于患者自身的诱导多能干细胞（iPSC）体外诱导培养以获得生殖细胞是治疗卵巢早衰患者的新思路，可以避免免疫排斥反应及异体干细胞移植的伦理困扰。近年已有报道将小鼠胚胎干细胞（ESC）及iPSC分化为类原始生殖细胞（PGCLC）及有功能的卵子[3-4]。然而，从人类ESC或iPSC体外制备人类卵子的研究仍未能取得成功，且高效率的PGCLC培养方法仍是研究的重点[5]。2018年Yamashiro等[6]将人类iPSC与小鼠卵巢组织进行体外共培养后分化成为类卵原细胞，但未进行减数分裂。本研究组于2015年已成功建立了卵巢早衰患者来源的iPSC（POF-iPSC）株[7]。本研究尝试使用POF-iPSC进行诱导分化，探讨其分化为减数分裂期细胞的潜能，为卵巢早衰患者的治疗提供新的思路。

材料与方法

一、细胞来源

POF-iPSC为课题组之前以卵巢早衰患者外周血单个核细胞进行核转染自行建系[7]。本实验所用细胞与研究方案均已经通过伦理审查。

二、主要试剂

视黄酸、氟维司群及糖原合酶激酶-3（GSK-3）抑制剂（CHIR-99021）购自美国MCE公司。激活剂A、大肠埃希菌表达的骨形态生成蛋白4（BMP 4）、抗坏血酸、表皮生长因子（EGF）购自美国Pepro Tech公司。由美国Invitrogen公司设计并合成引物的序列信息见表1。设计引物相关的基因包括：NANOG、POU转录因子家族OCT4、锌指蛋白转录抑制因子BLIMP1、发育多能性基因STELLA、生殖细胞及减数分裂相关基因DAZL、生殖细胞特异性蛋白DDX4、锌指蛋白转录抑制因子PRDM9、組蛋白家族成员γh2AX、联会复合物蛋白SYCP3及错配修复蛋白MLH1和辅肌动蛋白基因ACTIN。Trizol RNA提取试剂盒、逆转录PCR试剂盒购自日本Takara公司。X染色体着丝粒探针购自美国Abbott公司。抗DAZL抗体（ab34139）、抗SYCP3抗体（ab15093）和抗PRDM9抗体（ab101013）购自美国Abcam公司。驴抗兔IgG二抗（594 nm）购自美国Invitrogen公司。DAPI购自美国CST公司。细胞周期与凋亡检测试剂盒购自中国飞净公司。

三、方 法

1. PGCLC的诱导分化

制备培养液A、B、C、D，成分见表2。加入培养液A原代培养POF-iPSC为D0细胞（D0组），每日换液。加入培养液B培养2 d，再更换为培养液C培养5 d，共7 d，为D7细胞（D7组），每日换液。再加入培养液D培养7 d，为D14细胞（D14组），每日换液。对照组为D0细胞仅加入培养液A培养14 d，每日换液。

2. 不同诱导阶段细胞相关基因mRNA水平变化

采用实时定量PCR（qPCR）检测，取D0组、D7组、D14组细胞，提取总RNA、逆转录为模板DNA后，将模板DNA加入PCR反应体系中，反应条件为：95 ℃10 min，95℃15 s、60 ℃60 s，循环40次，72 ℃延伸30 s。以β-actin为内参照，使用2-ΔΔct法计算各基因mRNA相对表达水平。每组细胞设置3个复孔，重复3次测定，结果取平均值。

3. 不同诱导阶段的细胞相关标志物观察

采用免疫荧光染色法，取D0组、D7组、D14组细胞，抗DAZL抗体、抗SYCP3抗体和抗PRDM9抗体为一抗，二抗避光孵育40 min，DAPI染核。使用荧光显微镜观察。实验重复3次，结果取平均值。

4. 不同诱导阶段的细胞X染色体观察

采用荧光原位杂交技术（FISH）检测，取D0组、D7组、D14组及对照组细胞，固定于玻片中，使用X染色体着丝粒探针杂交，DAPI复染，荧光显微镜观察杂交信号MERGE。

5. 不同诱导阶段细胞的胞内染色体含量变化

采用流式细胞仪检测，取D0组、D7组、D14组及对照组细胞，固定、磷酸清洗后，添加碘化丙碇和核糖核酸酶混合液以染色。使用流式细胞仪在激发波长488 nm检测红色荧光及散射光。采用ModFIT LT 2.0（Verity Software House Company，美国）软件分析细胞DNA含量及光散射，分析位于二倍体细胞（即G0/G1期细胞）DNA含量的一半处的细胞的含量，即单倍体细胞的含量。实验重复3次，结果取平均值。

四、统计学处理

应用SPSS 22.0分析数据。计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞诱导过程中的形态变化

POF-iPSC在诱导过程中，D0组细胞形态为长梭形纤维样，D7组细胞体积变大，但胞质稀薄，具有多个触角，D14组细胞核及核仁变得明显，见图1。

二、不同诱导阶段生殖细胞相关基因mRNA相对表达水平比较

在mRNA相对表达水平上，NANOG随分化而下降，BLIMP1逐步上升，STELLA、OCT4、DDX4、γH2AX、MLH1于D7组最高，DAZL、SYCP3、PRDM9于D7组及D14组逐步升高（P均< 0.01），见图2。

三、不同诱导阶段生殖细胞相关标志物蛋白表达比较

D0组细胞中DAZL、PRDM9、SCP3蛋白均呈阴性表达;D7组细胞中DAZL及PRDM9蛋白呈阳性表达;D14组细胞中DAZL、PRDM9、SCP3蛋白均呈阳性表达，见图3。

四、不同诱导阶段细胞的FISH检测结果比较

针对X染色体着丝粒的FISH检测显示，对照组细胞中均未见单个X染色体显色的细胞;D14组的部分细胞核中有单个X染色体显色，提示其单倍体的可能。D0组、D7组、D14组及对照组细胞中均可见发生分裂状态的染色體，见图4。

五、不同诱导阶段的单倍体细胞比例比较

讨 论

体外诱导生成的卵巢早衰患者自身来源单倍体生殖细胞，具有广阔的应用前景。本研究应用POF-iPSC进行诱导培养后，经相关标志物及DNA含量鉴定提示部分细胞完成了减数分裂。

NANOG为胚胎干细胞自我更新所必需的基因之一，其缺失使得ESC分化[8]。STELLA被认为是与抑制体细胞基因表达以及卵母细胞低甲基化有关的基因[9]。本研究首先诱导POF-iPSC成为PGCLC，再展开减数分裂的诱导。qPCR结果显示，NANOG mRNA相对表达水平逐步降低，而抑制转录因子BLIMP1 mRNA相对表达水平逐渐上升，STELLA mRNA相对表达水平于D7最高。另外，OCT4在D7的mRNA相对表达水平达到最高，而在D7或D14，DAZL、DDX4的mRNA相对表达水平均有不同程度的提升。OCT4与PGCLC特异基因DAZL、DDX4激活相关[8]。免疫荧光染色结果提示，D7和D14的细胞中均有表达DAZL蛋白。本研究从基因和蛋白表达水平揭示了人iPSC在条件诱导下出现了PGCLC的变化。

减数分裂是体内生殖细胞发育的关键，而这也是体外诱导生殖配子的难点。SYCP3是存在于联会复合物中的特异蛋白;γh2AX是表达于减数分裂启动阶段的蛋白;PRDM9是第1次减数分裂转录激活及细线期的关键基因;而MLH1是减数分裂中与DNA修复相关的基因[10]。上述减数分裂相关基因的mRNA相对表达水平于D7或D14均发生了不同程度的提升。与之相符的是，免疫荧光染色结果中SYCP3于D14组表达，而PRDM9在D7组及D14组有表达。这提示分化细胞最迟在D7可能已经开始为减数分裂作准备，本研究中D14细胞已经出现联会复合物。

本研究诱导PGCLC的过程参考了Sasaki等[11]的诱导策略，即先诱导形成中胚层前体细胞，使用了激活物A和GSK-3抑制剂CHIR-99021，再进一步诱导形成PGCLC。这是效率较高的人类干细胞诱导为PGCLC的方法[6， 12]。

Bowles等[13]认为，视黄酸是雌性配子发生减数分裂的启动因素，并得到后续多项研究的证实。其机制可能是视黄酸启动STRA8基因的表达，从而使下游的生理过程得以出现。故本研究在培养后期加入视黄酸，刺激细胞启动减数分裂。FISH检测结果显示，一部分细胞胞内核膜消失，染色体发生分离。D14时有部分细胞仅展示单个X染色体着丝粒显色，提示这些细胞可能为单倍体细胞。为证实此推测，本研究使用碘化丙碇对细胞内DNA染色以分析DNA的含量。在二倍体细胞（G0/G1期）DNA含量一半的位置，D14细胞中出现（2.57±0.07）%的峰形（单倍体细胞比例），高于D0、D7及对照组细胞。以上结果说明了部分细胞发生了减数分裂。本研究中的POF-iPSC的分化过程与人类生殖细胞的发育生理相似。Li等[10]通过对不同孕周胎儿组织中原始生殖细胞的单细胞RNA测序分析，证实了与这一阶段相关联的基因有早期的NANOG、OCT4及稍晚的DAZL和DDX4，这些细胞标志物的分化程度不一。他还指出部分细胞已经具备对视黄酸的反应性，因为其表达了RA信号通路的基因STRA8，是启动第一次减数分裂的关键因子。

近年有学者采用小鼠ESC及iPSC定向分化为卵子，其培养方法可作为人类卵子培养研究的参考，但人类和小鼠卵子发生过程存在一定差异[3]。Hakabe等[14]将小鼠ESC和iPSC诱导分化为PGCLC，再与卵巢体细胞体外混合培养约2周后，获得了成熟的卵子，并成功得到了有生育能力的后代。最近Yamashiro等[6]诱导人类iPSC为PGCLC后，与小鼠胎儿性腺组织共培养4个月，其中部分细胞出现了卵原细胞样分化，相当于刚到达生殖嵴的原始生殖细胞。但通过qPCR和免疫荧光染色的检测，并未发现其有减数分裂的相关基因的表达和染色体核型的改变。Irie等[8]报道，人类PGCLC分化的重要调节因子是SOX17，其下游表达的BLIMP1抑制内胚层相关基因的表达。小鼠是依靠BLIMP1、PRDM14及AP2γ三重基因网络共同完成类似的过程，而人类中PRDM14基因在此过程处于相对不重要的位置。小鼠PGCLC的多能性相关基因是Sox2，而人类PGCLC并不表达[15]。这提示我们需重新审视人类卵子体外培养方法。

本研究中，虽iPSC分化后形态并未发生卵子样的改变，但单倍体细胞的出现提示添加的视黄酸可能是iPSC启动减数分裂的关键因素。欲使iPSC形态发生类卵母细胞改变，还需卵巢组织样内环境的调控，如人类卵巢组织与PGCLC的共培养后是否获得类卵子样的改变？这是接下来的研究应该关注的内容。

综上所述，本研究使用了POF-iPSC进行体外诱导分化，形成了发生减数分裂的单倍体细胞。本研究减数分裂的诱导过程为人类雌性配子诱导分化提供了参考，亦为卵巢早衰患者的治疗提供了新的思路。有关人类雌性配子发育所需要的体外环境，仍需日后开展研究探讨。

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（收稿日期：2018-12-18）

（本文编辑：林燕薇）