衰老对小鼠小肠上皮形态和增殖速度的影响

彭秀颖 刘慧玲 徐敏仪 陶金 吴斌

【关键词】 衰老;小肠上皮细胞;增殖;β-catenin;CyclinD1

The effect of aging on the morphology and proliferation rate of small intestinal epithelial cells in mice Peng Xiuying， Liu Huiling， Xu Minyi， Tao Jin，Wu Bin. Department of Gastroenterology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Wu Bin， E-mail： binwu001@ hotmail. com

【Abstract】 Objective To observe the changes of the morphology， cell count and the proliferation rate of the small intestinal epithelium in mice during aging.  Methods Mice were divided into the young （3-month group， n=9）， the middle-aged （12-month group， n=9） and the old groups （19-month group， n=9）. Each mouse received intraperitoneal injection of 5-Bromo-2-deoxyUridine （Brdu） at a dose of 100 mg/kg body weight. At 24-， 48- and 72-h after administration， 3 mice were sacrificed in each group and the jejunum and ileum tissues were collected and prepared for morphological observation. The proliferation rate of cells was analyzed by Brdu immunofluorescent staining. The expression levels of β-catenin and cyclinD1 were quantitatively measured.  Results Compared with 3-month-old mice， 12-month-old mice had longer villus， deeper crypt， more goblet cells， Paneth cells and stem cells. In the 19-month-old mice， the number of goblet cells and Paneth cells in the ileum， and the number of stem cells in the ileum and jejunum were significantly less compared with those in the 12-month-old mice. Brdu staining demonstrated that the number of Brdu positive cells and the migration length in the 19-month-old mice were significantly reduced compared with those in the other two groups（all P < 0.017）. The expression levels of β-catenin and cyclinD1 were significantly down-regulated in the 19-month-old mice（all P < 0.017）.  Conclusions During the process of aging， the proliferation rate of the small intestinal epithelial cells is reduced， the crypt depth， the number of goblet cells， Paneth cells and stem cells are decreased in mice.

【Key words】 Aging;Small intestinal epithelium;Proliferation;β-catenin;CyclinD1

小肠黏膜的主要功能是吸收和防御，其中肠上皮发挥了重要作用。小肠上皮细胞主要分为吸收性肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞、内分泌细胞、干细胞等，小肠上皮更新速度快，约4 ～ 5 d

更新1次，而隐窝中的潘氏细胞寿命约1个月。随着年龄增长，肠道功能逐渐减退[1-3]。对此已有相关研究，但因为取材位置、年龄选取等原因，结果各不相同。

本实验选取3个年龄段的小鼠，分别为3、12和19个月，分别对应人类年龄的青年、中年和老年阶段[4]。重点研究小肠增殖功能随衰老发生的变化，计数绒毛和隐窝长度以及各类细胞的个数，测定肠上皮更新的速度，并检测增殖相关的蛋白含量。

材料與方法

一、实验动物

无特定病原体（SPF）C57BL/6野生型小鼠27只，分为3 ～ 4个月（3个月组）、12 ～ 13个月（12个月组）、18 ～ 20个月（19个月组）3个年龄段。每年龄段各9只，雌雄不限。其中3 ～ 4个月小鼠体质量25 ～ 30 g、12个月以上小鼠体质量30 ～ 40 g，在中山大学附属第三医院动物房繁育养殖。动物实验符合伦理学要求。

二、主要试剂

5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu，Abcam）;苏木

素染液、伊红染液、PAS染液;Brdu抗体、cycli-nD1抗体（Abcam）、MMP-7抗体、Olfm4抗体、

PCNA抗体、β-catenin抗体（Cell Signaling Techn-ology）、β-actin抗体（Sigma）;DAB显色液（DAKO）、488波长抗大鼠荧光染液、594波长抗兔荧光二抗（ThermoFisher）。

三、实验步骤

1.动物处理

按100 mg/kg的量腹腔注射Brdu溶液，分别在24、48和72 h之后，每组随机取3只小鼠处死。小鼠处死后，从幽门往下5 cm取2 cm进行石蜡包埋切片，再取45 cm刮取黏膜蛋白（空肠）;再从回盲部开始，向上取2 cm进行石蜡包埋，再取4 ～ 5 cm刮取黏膜蛋白（回肠）。本实验已通过中山大学附属第三医院实验动物伦理委员会批准。

2.石蜡包埋

将小肠标本在10%甲醛固定12 ～ 24 h后，放入LeicaASP200s自动脱水机脱水，约15 h，程序完成，取出样本，在Leica包埋机中进行石蜡包埋。

3.苏木素-伊红（HE）染色

将玻片脱蜡、水化后，在玻片上滴加苏木素染液，90 s后用PBST洗去，返蓝后，将玻片浸入伊红染液80 s，用清水洗去染液，脱水封片。在显微镜下观察，每个玻片随机取10个视野，30个左右绒毛和隐窝统计其长度（每组9只小鼠）。

4. PAS糖原染色

将玻片脱蜡、水化后，滴加过碘酸染液，避光染色10 min，用PBST洗去染液后，再滴加Schiff试剂，避光染色15 min，用清水洗去染液，浸入PBST数分钟后滴加配套的苏木素染1 min，返蓝后脱水封片。在显微镜下观察，每个玻片随机取10个视野，约30个绒毛-隐窝轴统计其PAS阳性个数（每组6只小鼠）。紫红色为PAS阳性，蓝色为苏木素。

5. MMP-7免疫组织化学染色

将玻片脱蜡、水化后，在3%过氧化氢溶液中浸泡10 min，用pH 8.0的EDTA抗原修复液高压锅130℃ 3 min，自然放凉后滴加MMP7抗体（1∶100），放在孵育盒中，4℃冰箱放置14 h，PBST洗去一抗，滴加兔二抗（1∶200），37℃孵育2 h。滴加DAB显色1 min。显色完毕后苏木素染色1 min，脱水封片（6只）。棕色为MMP7阳性，蓝色为苏木素。

6.免疫荧光染色

注射Brdu，分别在24、48和72 h后处死小鼠，用Brdu抗体进行免疫荧光染色，统计Brdu阳性的肠上皮细胞在绒毛上的最大迁移距离和隐窝-绒毛轴上Brdu阳性细胞的个数。

将玻片脱蜡、水化后，用pH 8.0的EDTA抗原修复液高压锅130℃ 3 min，放凉后分别滴加OLFM4 （1∶400）（每组3只小鼠）、 Brdu（1∶100），4℃冰箱放置14 h，PBST洗去一抗。以下步骤均需要避光：分别加入荧光二抗[488抗大鼠（绿色荧光）、594 抗兔（红色荧光）荧光二抗]，37℃孵育90 min，孵育完毕后放入DAPI溶液（约1∶30 000

稀释）中浸泡30 min染核，用PBST浸洗数分钟后用防淬灭荧光封片剂封片后放入4℃冰箱保存。每张玻片取10个视野，统计约30个单位的数据。红色为Olfm4阳性，蓝色为DAPI阴性，绿色为Brdu阳性。

7.提取小肠黏膜蛋白和蛋白免疫印迹实验

按照总蛋白提取裂解液操作说明书对小肠黏膜组织总蛋白进行提取与定量，取样本蛋白进行电泳;电泳印记转至NC膜上;牛奶封闭2 h;分别加入如下抗体：β-catenin（1∶1 000）、cyclinD1（1∶200）、β-actin （1∶4 000），4℃放置过夜至少12 h。用TBST洗3 min洗去一抗，加入二抗（1∶5 000），常温孵育100  min，TBST洗3 min。滴加发光液，在Tanon自动化学发光仪内拍照（每组3只小鼠）。

8. 绒毛上的最大迁移距离计算

Brdu阳性细胞的位置到绒毛底部的长度取最大值（如果被标记的细胞已到达绒毛顶端则将迁移距离记为绒毛长度）。

四、统计学处理

使用SPSS 20.0进行统计学分析。非正态分布以中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验，使用Bonferroni法进行两两对比，P < 0.05/3（0.017）表示差异有统计学意义。结果以箱图显示，箱中横线代表中位数，箱体代表四分位差，圆点代表离散值。

结 果

一、小肠上皮的形态随衰老的变化

空肠绒毛长度3组对比 H=113.202，P < 0.001，

3个月小鼠绒毛长度大于12个月和19个月的小鼠（P均< 0.017），而12个月的小鼠和19个月的小鼠绒毛长度比较差异无统计学意义（P = 0.232）。回肠绒毛长度3组对比H=35.636，P < 0.001，12个月小鼠绒毛较3个月的小鼠长（P< 0.017），而19个月的小鼠较12个月的小鼠更短（P < 0.017），19个月和3个月小鼠对比差异亦有统计学意义（P < 0.017），见图1。

隐窝长度测量结果显示，空肠隐窝长度3组对比H=100.303，P < 0.001，回肠隐窝长度3组对比H=178.778，P < 0.001;12个月的小鼠空肠和回肠的隐窝长度都较3个月的小鼠大（P均< 0.017），19个月的小鼠空肠、回肠隐窝长度均比12个月的小鼠小，回肠隐窝长度与3个月的小鼠没有差别（P = 0.064），见图1。

二、小肠上皮不同种类细胞个数随衰老的变化

这3种染色的数量变化趋势在空肠和回肠基本一致。从数值上看，这些细胞数量变化非常小。最明显的变化是12个月小鼠比3个月小鼠数量增加。19个月小鼠与12个月小鼠相比，呈现数量减少和无明显差异两种情况。19个月小鼠与3个月小鼠对比，呈现数量上升和无明显差异两种情况，见图2、3。

三、小肠上皮增殖速度随衰老的变化

此结果在空肠和回肠中基本一致。综合对比3个月的小鼠与12个月的小鼠被标记的肠上皮细胞最大迁移距离和被标记的细胞个数，未能得到一致的结果，但是19个月的小鼠在3个时间段的最大迁移距离和被标记的细胞数目都低于3个月和12个月的小鼠。3个月和12个月的小鼠，被标记的肠上皮细胞在72 h已能够达到绒毛顶端，而19个月的小鼠则没有一个细胞能到达顶端。虽然 3个月的小鼠空肠中，一部分绒毛在72 h未能到达顶端，但是其绒毛长度比12个月要长，因此最大迁移距离同样大于19个月的小鼠。另外3个月和12个月的小鼠虽然在数值上没有明显的差异，但是观察切片可以发现，3个月的小鼠中被标记的细胞整齐聚集，而在12个月的小鼠则明显分散，见图4、5。

四、增殖相关蛋白的检测

用蛋白免疫印迹法检测了2个与增殖有关的蛋白：β-catenin和cyclinD1。蛋白条带结果显示，β-catenin和cyclinD1的条带在19个月组中明显浅于其他2组，而3个月组和12个月组未见明显的差异，见图6。

讨 论

衰老是生物无可避免的一种现象。随着年龄增长，人体器官的功能将逐渐减退。老年人普遍存在消化吸收和免疫功能减退的情况，与小肠黏膜的变化有密切联系。

按照Jacksonlab的说明书，3 ～ 6个月的小鼠对应人类年龄的20 ～ 30岁，10 ～ 14个月的小鼠对应人类年龄的38 ～ 47岁，18 ～ 24个月的小鼠对应人类年龄的56 ～ 69岁。在此之前，已有数篇文献对此做过研究，文献将3个月左右的小鼠与18个月以上的小鼠进行对比，得到衰老的小鼠隐窝长度增加，杯状细胞、潘氏细胞和干细胞数目增加的结果，对于绒毛长度的结论也不尽相同[5-8]。

考虑到直接将青年组和老年组对比，时间跨度过长，其中的变化并不清晰，为了更好的观察小鼠小肠黏膜随年龄的变化，本实验设立3个年龄段，对同一位置的空肠和回肠的绒毛长度、隐窝长度进行统计，并对杯状细胞、潘氏细胞和干细胞数进行计数。绒毛长度测量结果发现，空肠和回肠的结果并不一致。空肠的差别主要在3个月和12个月的小鼠之间，19个月小鼠与12个月小鼠没有差别。而回肠中，12个月的小鼠绒毛长度最长，3个月和19个月小鼠比12个月小鼠长度要短，但是总体变化很细微。这说明绒毛长度的对比结果随小肠部位不同而异。

隐窝长度的结果也不完全一致。在空肠，3个月的小鼠隐窝长度最小，而12个月和19个月没有明显差别。在回肠，19个月的小鼠隐窝长度低于12个月的小鼠，呈现下降趋势。但是共同点是，12个月的小鼠比起3个月的小鼠隐窝长度要大。从空肠的结果来看，隐窝长度在3个月之后12个月之前依旧有所增长，后来在衰老过程中逐渐萎缩。

为了研究不同种类的肠上皮个数是否随衰老有所变化，分别对各标记物染色。PAS糖原染色主要识别杯状细胞，MMP7免疫组化染色主要识别潘氏细胞。Olfm4是一种小肠干细胞标记物，研究表明，Olfm4在小鼠小肠的Lgr5+细胞中有非常高的表达量，因此可用来标记Lgr5+的小肠干细胞[9]。目前许多观点认为，隐窝底部Lgr5阳性的细胞很有可能性是小肠干细胞。本实验对杯状细胞、潘氏细胞和小肠干细胞进行染色，统计不同年龄段的数目，结果比较一致。这些细胞数目在12个月的小鼠中最大，而19个月与12个月对比，空肠的杯状细胞、潘氏细胞没有差异，回肠的杯状细胞、潘氏细胞则下降。而空肠与回肠的Olfm4阳性细胞数目都下降，提示Lgr5阳性的小肠干细胞数目减少。由此可见，小鼠3个月时，这几类细胞的数目并没有达到最大值。在3个月到12个月之间，数目依旧有所增长，随着小鼠衰老，肠道增殖功能减退，细胞数目可能会下降。总的来说，19个月的小鼠对比12个月的小鼠，隱窝长度减少，杯状细胞、潘氏细胞和干细胞数目都有减少的趋势，但是不会少于3个月的水平。

Brdu是一种胸腺嘧啶核苷类似物，对小鼠进行腹腔注射，可使其掺入小肠隐窝内正在复制的DNA中，从而标记隐窝底部的肠上皮，小肠上皮在增殖、分化和成熟的过程中，一直向绒毛顶端移动，直到移动到绒毛最顶端发生凋亡。经过一段时间处死小鼠，即可通过小肠上皮当前的位置评估小肠上皮的迁移情况[10]。因此，本实验使用Brdu标记正在复制DNA的肠上皮细胞来测定小肠增殖的速度。虽然空肠和回肠的结果具有差异，但是总体趋势一致。综合观察3个时间段，19个月的小鼠在不同时间段、不同部位的条件下，最大移动距离都低于3个月和 12个月的小鼠。之前有文献对比了2 ～ 4个月和20 ～ 22个月小鼠在72 h的移动距离，本实验与该文献结果一致[10]。本实验同时统计了隐窝-绒毛轴上Brdu阳性细胞的个数，发现19个月的小鼠标记的肠上皮个数也同样低于另外2组。19个月小鼠增殖速度明显低于另外2组，说明其增殖功能受损。需要特别说明的是，由于Brdu溶液是一种广泛使用的增殖标记物，如果腹腔注射不成功则不会在小肠中出现任何阳性信号。目前没有资料表明Brdu在用于标记时对目标器官产生额外影响。在查阅过的参考文献中，利用该标记物计算肠上皮迁移速率时，也并不针对这一操作设置空白对照组[11-13]。因此，本实验同样没有设置空白对照组。

经过蛋白免疫印迹检测的2个蛋白，其中β-catenin是经典Wnt/β-catenin通路的关键蛋白。cyclinD1是Wnt通路的下游蛋白，这是一种周期调控蛋白，具有促进细胞增殖的作用[14]。Wnt通路在小肠的作用是促进小肠上皮细胞增殖[15-16]。蛋白免疫印迹实验结果表明，19个月组的β-catenin和cyclinD1表达量比另外2组减少，提示Wnt通路减弱，这或许和19个月组小鼠增殖速度减慢相关。

综合细胞染色的结果来看，12个月的小鼠，隐窝长度增加，杯状细胞、潘氏细胞和干细胞数目都增加，形态学上发生了较大的变化，而Brdu染色却没有统一的结果。其最大迁移距离略高于3个月的小鼠，但是计数标记的细胞数却大多低于3个月的小鼠。此外，在观察过程中可以发现，12个月的小鼠标记细胞的排列较散乱。12个月的小鼠β-catenin和cyclinD1含量与3个月对比并无差异。也许在12个月时，小鼠的增殖功能受到了一些损伤，但是仍能维持肠上皮更新的速度。而19个月的小鼠，黏膜形态和细胞数目与3个月的小鼠相近，增殖功能却已经大幅减退。由此可见，小鼠衰老过程中，小肠形态和细胞数目的变化与小肠增殖功能的变化并不平行。这或许是因为在衰老的过程中，肠上皮单个细胞的质量一直在减退，需要更加精密的手段来检测这种变化。

总而言之，衰老的小鼠Wnt通路减弱，导致增殖功能减退，增殖速度减慢，绒毛长度、隐窝长度减少，各种类细胞数目有减少的可能。

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（收稿日期：2019-01-18）

（本文编辑：杨江瑜）