黑曲霉和乳酸芽孢杆菌两段青贮对甘蔗尾叶营养价值的影响

周俊华　王启芝　周志扬　穆胜龙　黄香　罗鲜青　黄丽霞　梁琪妹　孙俊丽　唐承明　何仁春

摘要：【目的】探讨黑曲霉和乳酸芽孢杆菌两段青贮对甘蔗尾叶营养价值的影響，为甘蔗尾叶有效利用和青贮饲料研究提供参考依据。【方法】以新鲜甘蔗尾叶为原料，分有氧发酵和无氧青贮两段进行，试验设对照组、试验I组、试验II组和试验III组。有氧发酵阶段，对照组、试验I组、试验II组和试验III组每千克新鲜甘蔗尾叶分别喷洒100 mL无菌水、10 mL黑曲霉菌液（8.75×107 CFU/mL，下同）+90 mL无菌水、20 mL黑曲霉菌液+80 mL无菌水、30 mL黑曲霉菌液+70 mL无菌水，在无菌室室温下有氧发酵48 h;厌氧发酵阶段，对照组每千克样品喷洒100 mL无菌水，3个试验组每千克样品均喷洒10 mL乳酸芽孢杆菌菌液（1.1×108 CFU/mL）+90 mL无菌水，混匀后罐装密封，室温青贮45 d后取样分析其常规营养成分、康奈尔净碳水化合物—蛋白质体系（CNCPS）营养指标、蛋白组分及碳水化合物组分。【结果】试验I组和试验III组粗蛋白（CP）水平显著高于对照组（P<0.05，下同）;3个试验组的木质素（Lignin）含量均显著低于对照组;淀粉（Starch）含量以试验III组最高，显著高于对照组和试验I组。试验组CNCPS碳水化合物组分较对照组均有所改善，尤其是试验III组效果最明显，试验III组的总碳水化合物（CHO）、非结构性碳水化合物（NSC）、快速降解碳水化合物（CA）、中速降解碳水化合物（CB1）和缓慢降解碳水化合物（CB2）水平最高，均显著高于对照组、试验I组和试验II组;非蛋白氮（PA）和中速降解蛋白（PB2）在对照组与试验组间差异显著，各试验组的快速降解真蛋白（PB1）和慢速降解真蛋白（PB3）含量高于对照组，不可利用蛋白（PC）显著低于对照组，黑曲霉和乳酸芽孢杆菌两段青贮可提高甘蔗尾叶CNCPS蛋白品质。【结论】综合考虑青贮甘蔗尾叶CNCPS碳水化合物组分及蛋白组分，以试验III组（2.625×106 CFU/g黑曲霉+1.1×106 CFU/g乳酸芽孢杆菌两段青贮）对改善甘蔗尾叶营养价值效果最佳。

关键词： 黑曲霉;乳酸芽孢杆菌;两段青贮;CNCPS;甘蔗尾叶

中图分类号： S816.53                                 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）05-1078-07

Abstract：【Objective】The aim was to explore the influence of two-stage silage while adding Aspergillus niger and lactic acid bacillus inoculants on the nutrient values of sugarcane tops silage and provide reference for effective utilization of sugarcane tops and silage research. 【Method】The test took the fresh sugarcane tops as materialand set aerobic fermentation and anaerobic silage. Control group， test  group I， test groupII  and test group III were set. At the first stage， for each kilogram fresh weight of sugarcane tops， the control group adding sterile water at dose of 100 mL/kg; Group I adding sterile water at dose of 90 mL and A. niger at dose of 10 mL（8.75×107 CFU/mL， the same below）; Group IIadding sterile water at dose of 80 mL and A. niger at dose of 20 mL; Group III adding sterile water at dose of 70 mL and A. niger at dose of 30 mL， indoor temperature，aerobic fermentation for 48 h. At the second stage， for each kilogram fresh weight of sugarcane tops， the control group adding sterile water at dose of 100 mL. The test groups adding lactic acid bacillus inoculant at dose of 10 mL（1.1×108 CFU/mL） and sterile water at dose of 90 mL to ensile，respectively. The cornell net carbohydrate and protein systems（CNCPS） was used to evaluate nutrient values of sugarcane tops silage after ensiling 45 d in canned sealed silage at indoor temperature. 【Result】Crude protein（CP） of the test group I and test group III was significantly higher than the control group（P<0.05，the same below）. The lignin content of three test groups was significantly lower than the control group. The starch content of the group III was significantly higher than the control group and group I，which was the highest in the four groups. The CNCPS carbohydrate of the test groups could be improved compared with control group， especially group III. Total carbohydrate（CHO）， non-structural carbohydrates（NSC）， rapidly degraded carbohydrate（CA）， intermediately degraded carbohydrate（CB1） and slowly degraded carbohydrate（CB2） of group III were the highest， significantly higher than the control group， test group I and test group II. There was significant diffe-rence in nonprotein nitrogen（PA） and intermediately degraded protein（PB2） between control group and test groups. Rapidly degraded protein（PB1） and slowly degraded protein（PB3） of test groups were higher than control group， but unusable protein（PC） was significantly lower than control group. A. niger and lactic acid bacillus two-stage silage could improve CNCPS protein quality if sugarcane tops. 【Conclution】According to the CNCPS carbohydrate fractionations and protein fractionations in sugarcane tops，the effects of test group III（2.625×106 CFU/g A. niger +1.1×106 CFU/g lactic acid bacillus two-stage silage）on improving sugarcane tops nutrient value is the best.

Key words： Aspergillus niger; lactic acid bacillus; two-stage silage; CNCPS; sugarcane top

0 引言

【研究意义】黑曲霉（Aspergillus niger）是丝状真菌的一个常见种，广泛分布于植物产品、粮食及土壤中，是美国FDA认证的安全菌种（GRAS）之一，2013年我国农业部批准允许黑曲霉在饲料中添加使用。黑曲霉生长旺盛、发酵周期短，不产生毒素，在我国古代人们就利用其制作酱料、酱油及米酒等。已有研究报道，黑曲霉是一种真核生物，耐pH范围为2.5～6.5，可适应温度26～37 ℃，细胞内具有内含子，高尔基体、内质网等蛋白后加工模块及复杂的基因排列方式等原核生物没有的特征，该特征使得黑曲霉可生产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶等多种酶及一些结构较复杂的蛋白质（Kuivanen et al.，2015;张熙和韩双艳，2016）。乳酸芽孢杆菌（Lactic acid bacillus）是能发酵糖类物质产生乳酸的一类杆菌，具有乳酸杆菌优势，同时具有芽孢杆菌抵抗不利环境的特性，是目前益生菌研究的热点之一。甘蔗尾叶是甘蔗收割后的副产品，每年11月—翌年4月是南方甘蔗收割期，也是南方的枯草期，将黑曲霉和乳酸芽孢杆菌添加到甘蔗尾叶中进行有氧发酵及无氧青贮，既能合理利用甘蔗尾叶以缓解反刍动物越冬度春青绿饲料不足的问题，又可将田间废弃物变废为宝。【前人研究进展】目前，针对甘蔗尾叶的青贮已有不少研究报道。Pedroso等（2008）、dos Santos等（2015）研究发现，添加布氏乳杆菌可提高青贮甘蔗尾叶的有氧稳定性，降低乙醇含量及酵母菌数量，但对于改善青贮甘蔗尾叶的干物质损失没有效果。Carvalho等（2012）在甘蔗尾叶青贮过程中添加丙酸及布氏乳杆菌，发现其可提高甘蔗尾叶的青贮品质，抑制梭酸菌等有害菌生长。王定发等（2015）研究发现，在甘蔗尾叶青贮过程中添加纤维素酶或丙酸可提高其饲用价值。Chizzotti等（2015）研究发现，甘蔗尾叶在青贮过程中添加氧化钙可降解青贮甘蔗尾叶纤维素水平，但氧化钙添加量不能超过15 g/kg，否则会影响牛的日采食量及生产性能。Daniel等（2015）的研究结果表明，青贮过程中添加开菲尔乳杆菌可减少青贮甘蔗尾叶的营养损失，提高乙酸及1，2-丙二醇水平。Olivcira-Borgatti等（2015）研究表明，在甘蔗尾叶青贮过程中添加氢氧化钠、氢氧化钙及氧化钙可降低其碳水化合物损失，同时提高青贮甘蔗尾叶的有氧稳定性。穆胜龙等（2018）分别添加植物乳杆菌和布氏乳杆菌对甘蔗尾叶进行青贮，发现两种菌均可改善甘蔗尾叶青贮效果。【本研究切入点】虽然已有不少研究甘蔗尾叶青贮的文献报道，但至今未见针对甘蔗尾叶两段青贮的研究报道。康奈尔净碳水化合物—蛋白质体系（Cornell net carbohydrate and protein system，CNCPS）集饲料化学分析、植物细胞壁组分及反刍动物的消化利用于一体，利用其对青贮样品进行营养价值评定，较尼龙袋技术、Weeden体系更能真实反映所测样品的营养特性，提供更具参考价值的分析结果（李威等，2008）。【拟解决的关键问题】以新鲜甘蔗尾叶为原料，第一阶段喷洒黑曲霉进行有氧发酵，第二阶段喷洒乳酸芽孢杆菌进行厌氧青贮，通过CNCPS评定黑曲霉和乳酸芽孢杆菌两段青贮对甘蔗尾叶营养价值的影响，以期为甘蔗尾叶有效利用和青贮饲料研究提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

甘蔗尾叶取自广西崇左市扶绥县甘蔗种植区，人工收割，切碎至2 cm备用，新鲜甘蔗尾叶的常规营养成分见表1。黑曲霉和乳酸芽孢杆菌由广西九通王环保生物工程有限公司赠送。

土豆液体和固体培养基用于黑曲霉和乳酸芽孢杆菌活化及菌落计数。土豆液体培养基：200 g土豆，添加1 L蒸馏水，煮沸15 min，3层纱布过滤，滤液添加20 g葡萄糖微热溶解，蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌15～20 min。土豆固体培养基：在土豆液体培养基中加1.5%琼脂煮沸熔化，121 ℃灭菌15～20 min。

1. 2 菌落计数

乳酸芽孢杆菌接种液：采用平板计数法，将乳酸芽孢杆菌菌种培养至第二代进行甘蔗尾叶青贮接种，用无菌水对其接种菌液逐级稀释，对10-5、10-6和10-7 3个稀释梯度进行平板涂布，每个梯度3次重复，37 ℃厌氧培养48 h后计数。

黑曲霉接种液：在接种液中加入玻璃球，振荡器振荡后以3层纱布过滤，用无菌水对所得孢子悬浮液逐级稀释，采用血球计数法计算黑曲霉孢子浓度。

1. 3 试验设计

试验设4个组，即对照组、试验I组、试验II组和试验III组，每组3个重复，分两个阶段进行。第一阶段有氧发酵：对照组、试验I组、试验II组和试验III组每千克样品分别对应喷洒100 mL无菌水、10 mL黑曲霉菌液+90 mL无菌水、20 mL黑曲霉菌液+80 mL无菌水、30 mL黑曲霉菌液+70 mL无菌水，在无菌室室温下有氧发酵48 h;第二階段无氧青贮：对照组每千克样品喷洒100 mL无菌水，3个试验组每千克样品均喷洒10 mL乳酸芽孢杆菌菌液+90 mL无菌水，青贮原料与添加剂充分混匀，罐装密封，室温青贮45 d后取样分析。黑曲霉菌液浓度为8.75×107 CFU/mL，乳酸芽孢杆菌菌液浓度为1.1×108 CFU/mL。

1. 4 测定项目及方法

各试验组样品经风干、粉碎过1 mm网筛处理后，储存于样品袋中，以备分析。干物质（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）和粗灰分（Ash）参照AOAC（1990）的方法进行测定，中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、酸性洗涤不溶蛋白（ADIP）、中性洗涤不溶蛋白（NDIP）和木质素（Lignin）参照van Soest等（1981）的方法进行测定，可溶性粗蛋白（SOLP）参照Krishnamoorthy等（1983）的方法进行测定。

1. 4. 1 CNCPS碳水化合物计算 根据下列公式（Sniffen et al.，1992）进行计算：

式中，CHO为总碳水化合物，Strach为淀粉，CB1为中速降解碳水化合物，CB2为缓慢降解碳水化合物，CA为快速降解碳水化合物，CC为不可利用碳水化合物（木质素×2.4），NSC为非结构性碳水化合物。

1. 4. 2 CNCPS蛋白组分计算 根据下列公式（Sniffen et al.，1992）进行计算：

式中，PA为非蛋白氮（NPN），PB1为快速降解真蛋白，PB2为中速降解真蛋白，PB3为慢速降解真蛋白质，PC为与单宁、木质素结合不能被机体消化利用的蛋白部分。

1. 5 统计分析

试验数据采用Excel 2016进行初步处理，应用SPSS 16.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），同时进行Duncan’s新复极差多重比较。

2 结果与分析

2. 1 黑曲霉和乳酸芽孢杆菌两段青贮对甘蔗尾叶常规营养成分的影响

由表2可知，各组间的干物质和中性洗涤纤维含量差异均不显著（P>0.05，下同），其中3个试验组的干物质含量较对照组均有提高，而中性洗涤纤维含量较对照组均有降低;各组间的粗蛋白含量差异显著（P<0.05，下同），试验I组和试验III组显著高于对照组，而试验II组显著低于对照组;3个试验组的粗脂肪含量均显著高于对照组，但试验组间差异不显著;对照组和试验I组的酸性洗涤纤维含量显著高于试验II组和试验III组;试验II组的粗灰分含量显著高于另外2个试验组和对照组，试验I组和试验III组的粗灰分含量差异不显著，但二者显著低于对照组。

2. 2 黑曲霉和乳酸芽孢杆菌两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS营养指标的影响

由表3可知，可溶性粗蛋白、中性洗涤不溶蛋白和木质素在各组间均存在显著差异，其中试验I组和试验II组的可溶性粗蛋白含量显著高于对照组，3个试验组的中性洗涤不溶蛋白含量均显著高于对照组，而3个试验组的木质素含量均显著低于对照组。非蛋白氮（NPN）含量以试验I组最高，显著高于对照组和其余2个试验组;对照组和试验III组的酸性洗涤不溶蛋白含量差异不显著，但二者显著高于试验I组和试验II组;淀粉含量以试验III组最高，试验II组最低，二者与对照组和试验I组间存在显著差异。

2. 3 黑曲霉和乳酸芽孢杆菌两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS碳水化合物组分的影响

由表4可知，试验III组的总碳水化合物、非结构性碳水化合物、快速降解碳水化合物、中速降解碳水化合物和缓慢降解碳水化合物含量均最高，且显著高于对照组和另外2个试验组，但其不可利用碳水化合物含量最低，显著低于对照组和另外2个试验组;对照组的非结构性碳水化合物、快速降解碳水化合物和缓慢降解碳水化合物含量均最低，显著低于3个试验组，但其不可利用碳水化合物含量最高，显著高于3个试验组;中速降解碳水化合物含量则以试验II组最低。

2. 4 黑曲霉和乳酸芽孢杆菌两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS蛋白组分的影响

由表5可知，试验II组和试验III组的非蛋白氮含量显著低于对照组和试验I组，但二者间差异不显著，以试验I组的非蛋白氮（PA）含量最高;快速降解真蛋白和慢速降解真蛋白含量以试验II组最高，其次是试验III组，二者间存在显著差异，且均显著高于对照组和试验I组，但试验II组的中速降解真蛋白含量最低，显著低于对照组和试验I组;对照组的不可利用蛋白含量最高，显著高于各试验组，但其慢速降解真蛋白含量显著低于各试验组。

3 讨论

3. 1 两段青贮对甘蔗尾叶常规营养成分的影响

粗蛋白是衡量青贮饲料营养价值的重要指标之一。在青贮过程中，蛋白质在植物酶的作用下降解为氨基酸、多肽等非蛋白氮，非蛋白氮在微生物作用下进一步降解为氨，进而影响青贮饲料的营养价值。本研究中，黑曲霉和乳酸芽孢杆菌两段青贮甘蔗尾叶，试验I组和试验III组的粗蛋白含量较对照组均显著提高，可能是青贮过程中乳酸菌分泌有机酸，致使pH降低，从而抑制植物酶活性。张宁等（2013）研究发现乳酸菌剂可提高青贮水稻秸的粗蛋白水平，赖玉娇等（2014）研究发现乳酸菌剂可提高青贮苜蓿的粗蛋白水平，本研究结果与上述研究结果一致。动物机体利用纤维很大程度上是利用微生物酶的分解产物或微生物的代谢产物。日粮纤维素水平提高，加快食糜在消化道中的流通，影响机体对淀粉、蛋白质、脂肪等营养物质的吸收，降低饲粮可利用能值，但同时纤维是反刍动物的一种必要营养素。美国国家研究理事会（NRC）推荐泌乳牛饲粮中酸性洗涤纤维水平至少为19%～21%或中性洗涤纤维水平为25%～28%，且日粮中中性洗涤纤维总量的75%必须由粗饲料提供（杨凤，2000）。纤维素酶降解植物的半纤维素和纤维素，增加青贮发酵底物，提高青贮饲料的消化率及采食量（庄益芬等，2009）。本研究中，试验组与对照组间中性洗涤纤维含量差异不显著，但各试验组较对照组均有所降低，3个试验组的酸性洗涤纤维含量也低于对照组，说明黑曲霉和乳酸芽孢桿菌两段青贮在一定程度上可降低青贮甘蔗尾叶的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，可能是黑曲霉分泌积累纤维素酶及两种菌的互作效应提高了青贮甘蔗尾叶适口性及营养价值。

3. 2 两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS营养成分的影响

动植物体中的非蛋白氮（NPN）包括酰胺类、游离氨基酸、生物碱、铵盐、含氮的糖苷及脂肪、硝酸盐、甜菜碱、胆碱等（杨凤，2000）。非蛋白氮在反刍动物营养中具有重要意义，但对于非反刍动物基本上没有利用价值。本研究中， 试验I组的非蛋白氮含量显著高于对照组，试验II组和试验III组间差异不显著，但显著低于对照组，说明试验II组和试验III组可改善青贮甘蔗尾叶营养价值。淀粉是瘤胃内产生挥发性脂肪酸的主要底物，且高水平淀粉有利于瘤胃微生物发酵产生挥发性脂肪酸，试验III组淀粉含量显著高于其他组，说明试验III组可为反刍动物提供较多的能量来源。

饲料中蛋白肽链上的氨基酸残基与碳水化合物中的半纤维素结合生成聚合物，该聚合物含有11%的氮，但完全不能被瘤胃微生物分解，该聚合物的检测分析过程与酸性洗涤纤维相同，所含氮被称为酸性洗涤不溶氮，70%相对湿度及60 ℃温度是酸性洗涤不溶氮生成的最适宜环境，时间越久，生成的酸性洗涤不溶氮越多。本研究中，试验I组和试验II组的酸性洗涤不溶蛋白含量显著低于对照组，可能是试验过程中青贮原料填充的紧密程度造成相对湿度及温度有偏差所致。木质素是植物生长成熟后才出现在细胞壁中的物质，动物机体所分泌的酶均不能使其降解（杨凤，2000）。本研究中，各试验组木质素含量均显著低于对照组，且以试验III组含量最低，可能是黑曲霉分泌降解酶或两种菌本身消化分解青贮甘蔗尾叶的木质素。

3. 3 两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS碳水化合物组分的影响

碳水化合物是多羟基的酮、醛或其简单衍生物及能水解产生上述化合物的总称（杨凤，2000）。碳水化合物是一类重要的营养素，占动物饲粮的50%以上。依照CNCPS将碳水化合物划分为非结构性碳水化物（Non-structural carbohydrate，NSC）和结构性碳水化合物（Structural carbohydrate，SC）。其中緩慢降解碳水化合物和不可利用碳水化合物划归结构性碳水化合物，快速降解碳水化合物和中速降解碳水化合物划归非结构性碳水化合物。结构性碳水化合物是反刍动物重要的碳架及能量来源，非结构性碳水化合物会影响反刍动物瘤胃能氮代谢及瘤胃发酵。本研究中，试验III组的总碳水化合物、非结构性碳水化合物、快速降解碳水化合物、中速降解碳水化合物和缓慢降解碳水化合物含量均最高，说明试验III组CNCPS碳水化合物组分最优，可能是随着黑曲霉添加量的增加，纤维素酶、木聚糖酶等积累越多，同时黑曲霉和乳酸芽孢杆菌自身的消化代谢促使试验III组CNCPS碳水化合物组分最优。目前，有关添加剂对青贮饲料CNCPS碳水化合物组分的影响研究较少，而两段青贮对青贮甘蔗尾叶CNCPS碳水化合物组分的影响研究尚无报道，因此两段青贮的机理有待进一步研究。

3. 4 两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS蛋白组分的影响

CNCPS依据蛋白在瘤胃内的降解特性，将其划分为非蛋白氮（PA）、真蛋白（PB）和结合蛋白（PC）三部分，其中PB又被划分为快速降解真蛋白（PB1）、中速降解真蛋白（PB2）和慢速降解真蛋白（PB3）三部分。结合蛋白（不可利用蛋白）包括与木质素结合的蛋白、单宁蛋白复合物及高度抵抗微生物及哺乳动物酶类的蛋白，其在实验室分析过程中不被酸性洗涤剂溶解，在瘤胃微生物也无法降解，动物机体不能消化吸收。青贮饲料中梭菌等有害菌的活动及蛋白水解酶的作用，可引起青贮饲料中蛋白含量的变化。饲料中不可利用蛋白含量越低，其蛋白生物学效价越高。中速降解真蛋白和慢速降解真蛋白在反刍动物瘤胃中的降解速率分别为中速和慢速，部分可进入小肠形成瘤胃蛋白，对提高反刍动物生产性能具有显著作用（Anil et al.，2000）。本研究中，各试验组的快速降解真蛋白和慢速降解真蛋白含量均高于对照组，不可利用蛋白含量低于对照组。在第二阶段厌氧青贮，乳酸芽孢杆菌在厌氧环境下大量繁殖，产生有机酸使青贮pH下降，抑制梭菌等有害菌的活动及青贮原料自身所带蛋白酶的活性，减少其对蛋白的破坏。由上述结果可知，各试验组蛋白生物学效价均高于对照组，黑曲霉和乳酸芽孢杆菌两段青贮可提高甘蔗尾叶CNCPS蛋白品质。

4 结论

综合考虑青贮甘蔗尾叶CNCPS碳水化合物组分及蛋白组分，以试验III组效果最佳，即2.625×106 CFU/g黑曲霉+1.1×106 CFU/g乳酸芽孢杆菌（CFU/g是菌液浓度乘以所喷洒的菌液体积，再除以该体积菌液喷洒的甘蔗尾叶质量所得）两段青贮对改善甘蔗尾叶营养价值效果最佳。

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（責任编辑 罗 丽）