重组纳豆激酶的研究进展

赵福永 严寒 任广旭 高梦祥 刘虹 王靖

摘 要：纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶，具有较强的直接溶解血纤维蛋白的特性，与当前的溶栓药物相比具有诸多优点，已成为新型溶栓药物开发的焦点。本文首先简要介绍了纳豆激酶基因及纳豆激酶分子的理化特性和生物学功能，对当前国内外采用基因工程技术（密码子优化、点突变、高效表达系统构建等）重组表达纳豆激酶的研究进展进行了综述，分析了其中存在的主要问题和不足以及商业化生产重组纳豆激酶的可能性，对纳豆激酶在医药、食品等行业中的应用前景进行了展望。

关键词：纳豆激酶;溶栓作用;重组表达策略;应用前景

纳豆激酶（Nattokinase，NK）最早由日本学者须见洋行在大豆发酵产品纳豆中发现并命名[1]。NK主要是由纳豆发酵菌纳豆杆菌代谢产生的一种丝氨酸蛋白酶，具有较强的纤维蛋白溶解特性，能溶解血栓。相较于目前临床上常用的溶栓药物尿激酶、链激酶和组织型纤溶酶原激活剂，NK制剂具有安全、高效、可口服、易吸收、价格低和纤溶活力强等优势，现已成为新型溶栓药物开发的焦点。此外，NK还被发现具有降胆固醇、降血脂、降血压、抗菌和抗氧化等多方面的保健作用[2-5]。近年来，国内外学者在NK高产菌种选育、发酵工艺优化、高效分离与纯化技术、酶活测定、溶栓机理及产品开发与应用等方面进行了广泛的研究，取得了一批显著的成果。传统NK的生产方法主要是从发酵纳豆中进行提取，由于野生型纳豆杆菌的胞外分泌型蛋白过多，导致NK分离纯化困难，且产量和酶活偏低，不利于NK的产业化发展和市场需求。随着现代分子生物学技术的迅速发展，NK重组表达技术也日趋成熟和完善，本文对NK的重组表达研究进展进行了综述。

1 NK基因及其编码蛋白特性

1992年，Nadamura 等[1]首次从纳豆杆菌中克隆获得了NK基因（aprN）全长序列。其编码多肽链长381氨基酸（AA），其中N端29 AA为信号肽，其后的77 AA为具有分子伴侣作用的前导肽，成熟肽长275 AA，是一种单链多肽酶。该酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶，其N末端为丙氨酸，相对分子质量约为27.7 kDa。截止2018年11月，作者从NCBI网站共搜索到12条NK基因全长序列。对附表中NK基因核苷酸序列比对发现，序列KF734090、FJ376817和FJ407060均为1 089 bp，缺失信号肽区的57 bp，其余均为1 046 bp，序列间核苷酸一致性在97%～100%之间。对成熟肽序列比对发现，所有成熟肽长度均为275 AA，且位于活性中心的Asp32、His64和Ser221及结合中心的Ser125、Leu126和Gly127相同，说明不同菌株来源的NK功能极为保守。NK的等电点为8.6，最适pH值为8.0，最适温度为45℃，多次冻融对酶活影响不大，且分子内无二硫键[6]。但是，酶活易受金属离子影响，Hg2+和Cu2+对酶活具有明显抑制作用，而Ca2+、Mn2+、Fe2+则对酶活有明显的激活作用。此外，乙二胺四乙酸（EDTA）对NK有轻微的抑制作用，而蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）对NK有明显的抑制作用，可使酶活完全丧失[6]（附表）。

2 NK的溶栓功能、机理及保健功效

NK氨基酸序列与枯草杆菌蛋白酶E、DFE和QK-2等具有很高的同源性和结构相似性，同属丝氨酸蛋白酶家族，但只有NK对血纤维蛋白具有水解作用，且表现出极高的底物特异性[1，7]。因此，NK是一种良好的血栓溶解药物，其溶栓作用主要通过4条途径实现：（1）直接水解纤维蛋白。NK不能直接水解血浆纤维蛋白原，但可以水解交联后的纤维蛋白，将其降解为可溶性产物，从而溶解血栓。（2）刺激血管内皮细胞产生t-PA。t-PA在体内纤溶系统中起着重要作用，它可激活体内的组织纤溶酶原形成纤溶酶，进而溶解纤维蛋白。（3）激活尿激酶原转化为尿激酶。NK可将体内的尿激酶原激活转化为尿激酶，从而使内源性纤溶酶的量和活性间接增强。（4）降解和失活t-PA和尿激酶的抑制剂 pAI-1[8]。此外，NK还具有预防血栓形成、抑制血小板凝集、预防高血压、改善血流与微循环等保健功效[2-5，9]。

3 重组NK的高效表达策略、技术及主要问题

基因工程领域常采用密码子优化、选择强启动子或特异启动子、增删表达调控元件（增强子、信号肽、内含子、Kozak 序列等）、分泌表达、融合表达等策略与技术，以实现目的基因的高水平转录和高效翻译，并结合适宜的表达系统及发酵工艺最大量提高目的蛋白的表达水平。NK基因的成功克隆，为利用基因工程技术产业化生产重组NK奠定了基础。

3.1 密码子与表达调控元件优化提高表达量与酶活

韩岚等[10-12]和刘靓蕾等[13]通过密码子优化设计并人工合成了含和不含内含子的2种NK基因。对番茄果实、烟草和甜瓜瞬时转化结果表明，在番茄果实特异启动子E8调控下的NK表达量明显高于组成型启动子35S调控下的表达量;同时，有内含子的NK的表达量明显高于无内含子的表达量，且纤溶酶活性也较高。刘朔[14]对NK成熟肽编码区进行密码子优化后，用分泌表达策略在毕赤酵母中进行表达，表达量相较优化前提高了3.5倍，活性达512 IU/mL。葛春蕾等[15]通过串联3个PHpaII启动子调控NK基因在枯草芽孢杆菌WB800中进行高效分泌表达，NK产量最高达 213.30 FU/mL，相比单个启动子 PHpaII提高了92.51%。何孝天[16]比较3种不同信号肽（wapA、yncM、pre）对NK分泌表达的影响发现，wapA介導的NK在枯草芽孢杆菌中的表达量明显高于原信号肽pre，且酶活也较高，达1 052 FU/mg。Liang等[17]利用协助胞外表达的启动子pel B，实现了NK在大肠杆菌的胞外可溶性表达，但表达量偏低。Chiang等[18]将NK与油脂蛋白融合表达，通过表达蛋白在含有甘油三酯和磷脂等成分的人工油体中复性，获得了有活性的蛋白。Wu等[19]通过优化启动子，在枯草芽孢杆菌中使NK的表达量增加了136%，酶活达1 999U/mL。

3.2 点突变提高热稳定性、酶活和pH值耐受性

对NK热稳定性和pH值耐受性的改善，将有助于在工艺生产环节中保证酶活，并延长其在机体内的作用时间。赵菡等[20]采用点突变技术获得了酶活提高的NK突变体Q59E及热稳定性提高的突变体N218D，且双突变体Q59E/N218D的热稳定性进一步提高，使半衰期延长了约2.75倍，而酶活与野生型酶相当。P14L和N76D突變体则可使65℃下的半衰期由20min分别延长至30min和50min[21]。D36G突变体可使热稳定性提高20%，比活力提高16.6%[22]。L31I突变体的催化效率是野生型酶的2倍，双突变M222A/I31L和T220S/I31L的酶活明显高于单突变，且M222A/I31L的氧化稳定性也高于野生型酶。Wu等[23]证实，若NK第100位氨基酸为体积大的或带正电荷的侧链，则其底物结合和催化活性会大幅度下降，而若第101位为此类氨基酸则其酶活明显提高;第126位的任意突变均会破坏活性中心的结构，从而使酶活大幅度下降。Zheng等[24]对NK分子三维结构模型分析发现，Ser33、Asp60、Ser62和Thr220之间形成的氢键对稳定水解反应的过渡态至关重要，任一位点的突变导致氢键的移除均会增加过度态的自由能，从而降低NK对底物的催化效率。周波[25]对Ser182和Leu203位点的点突变性质研究发现，NK重组酶的最适pH值的变化与氨基酸替换呈现出相关性：酸性氨基酸有利于酶在酸性范围内稳定，而碱性氨基酸有利于酶在碱性范围内稳定。此外，DNA shuffling人工分子进化技术对于目的基因分子改性具有积极作用。Cai等[26]建立了纳豆芽孢杆菌AS 1.107、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CICC 20164和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CICC 10092三个菌株的NK同源基因的突变子库，筛选到催化效率比野生型提高2.3倍的NK突变体。

3.3 NK重组表达系统

NK已在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳球菌、毕赤酵母和昆虫细胞等表达系统中实现了表达，以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母报道较多。在大肠杆菌（BL21）表达系统中，NK酶原基因可表达出有活性的蛋白产物，表达量要明显高于枯草芽孢杆菌表达系统，但活性相对偏低[27]，且缺乏信号肽和前导肽序列的NK基因表达产物易形成包涵体，常规方法很难使其体外复性[28-29]。张淑梅等[30]在大肠杆菌（DH5α）中表达的NK蛋白占菌体蛋白的21.5%，其1 mg干粉的溶栓活性相当于2 000 U尿激酶。童煜[31]获得的重组NK蛋白占菌体蛋白的36%，但1 mg干粉的溶栓活性仅相当于600 U尿激酶。郭文秀[32]对大肠杆菌HB101和BL21表达NK比较研究发现，前者表达量约占菌体蛋白的25%，后者略高，为31%。枯草芽孢杆菌是NK的天然表达菌种，可实现可溶性表达。Chen等[33]通过发酵条件优化，用摇床培养和发酵罐培养表达NK，使酶活分别达到了71 500 CU/mL和77 400 CU/mL。Cui等[34]采取信号肽、启动子、顺式调控元件逐步优化策略，发现去除了5UTR端CodY结合序列的启动子P08和信号肽SPwapA组合，以胞外酶缺失型枯草芽孢杆菌菌株WB800作为表达宿主菌，可使NK的分泌表达水平达292 FU/mL。Wei等[35]应用基因敲除技术构建了地衣芽孢杆菌胞外酶缺失型基因工程表达菌株BL10，并结合信号肽优化，实现了NK的高水平稳定表达。相较于优化前，发酵活性最高可达33.83 FU/mL，提高了229%。若对BL10的全合成培养基进行优化，NK的纯度和比活力还可进一步提高[36]。敬俊锋等[37]在毕赤酵母X33中表达825 bp的NK成熟肽基因，每毫升培养物活性相当于195 U尿激酶。闫少华[38]对NK在毕赤酵母中重组表达的大规模发酵培养条件进行了探索。Liang等[39]采用分泌表达策略在食品级菌种乳酸乳球菌中成功表达了NK，每毫升培养物活性相当于41.7 U尿激酶。研究结果为重组NK的直接口服应用研究提供了新思路。此外，NK在昆虫细胞[40]和病毒[41]中也实现了有活性表达。

不同的表达系统因自身的特性各有优缺点。从上述NK的表达结果来看，大肠杆菌表达系统的表达量相对较高，且易于纯化，但表达产物无活性或活性极低，主要以包涵体形式存在，需要通过后续复性才能获得有功能的酶;枯草芽孢杆菌作为NK产生的天然菌种，其表达活性最好，但是胞外分泌型杂蛋白多，纯化难度大;毕赤酵母表达系统的纯度高，但存在活性低，表达量相对较小的缺点。

要实现NK的高效重组表达，笔者认为可以从以下几个方面着手，逐步实现。首先，在对NK蛋白分子结构和特性认识的基础上，采用点突变或DNA shuffling技术等获得能在表达宿主菌或细胞中高效转录和翻译的突变基因;其次，将NK的前导肽和成熟肽基因同时表达。NK的前导肽是一种分子内分子伴侣，在NK的正确折叠过程中发挥着重要作用。大肠杆菌中和毕赤酵母中表达无前导肽的蛋白的活性要远低于有前导肽的[42-43]。第三，优化表达调控元件，构建高效表达载体。如选用强启动子或特异启动子、选择合适的信号肽、添加内含子或增强子、加装Kozak序列、去除CodY等负调控元件等。第四，选用蛋白酶缺失型宿主细胞，采用融合表达或分泌表达策略。宿主细胞蛋白酶缺失可以极大地降低对目的蛋白的水解风险，从而提高目的蛋白的表达量。如胞外蛋白酶缺失型枯草芽孢杆菌基因工程菌株WB400、WB600、WB800以及地衣芽孢杆菌基因工程表达菌株BL10等。高产、高活性重组表达产品的获得，既涉及上游的基因优化、表达载体构建以及表达系统的选择，也涉及下游的发酵条件优化、分离纯化技术等，应同时加以综合考虑。

4 NK重组表达产品的应用与开发前景

随着对NK研究的不断深入，NK产业展现出了巨大的商业价值和广阔的应用前景。首先，NK作为辅助溶栓的保健品药物，现已在发达国家广泛使用。日本是NK产品的最大生产国家，市售产品名类众多，如日研纳豆激酶胶囊、ASTALIVE纳豆激酶等。日本生物科学研究所已推出了第四代纳豆激酶制品（3 000FU）。美国市面上也有多种NK产品销售，我国纳豆激酶制剂-恩开胶囊已进入生产工艺中试阶段。其次，NK作為一种碱性丝氨酸蛋白酶，可作为脱毛剂用于皮革行业。与传统皮革脱毛方法相比，酶法脱毛不仅可以保护和软化皮革，改良产品的柔软度、可着色度、洁白度等，还环保高效。第三，NK可作为添加剂用于洗涤行业。有研究表明，NK是一种有机溶剂耐受性蛋白酶，对洗涤剂有极强的耐受性[44-45]。因此，可通过NK将一些大分子蛋白类污渍酶解成易溶于水的小分子片段，达到快速去污的目的。第四，可作为饲料添加剂，用以改善饲料的营养价值和利用率。NK作为一种蛋白酶，能将高蛋白含量的豆粕、玉米等饲料中大分子蛋白质降解为小分子多肽，从而提高其利用率，降低养殖成本，实现增收。第五，利用转基因技术，实现NK的生物反应器表达，开发功能性食品。如在番茄、甜瓜、生菜等生食类瓜果和蔬菜中或食品级乳酸菌中高表达NK，人类可直接吸收和利用NK，无需分离与纯化等步骤，既降低了生产成本，还可达到药食两用的目的。

5 结论

NK具有广阔的开发前景。采用基因工程技术制备重组NK，不仅具有分离纯化方便、产量高、活性高等优势，还具有安全可靠、生产成本低廉等经济效益和社会效益。相信不久的将来，NK将在医药、食品、养殖、化工等行业和领域形成新的产业。

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Research Advancement on Recombinant Nattokinase

ZHAO Fu-yong1，YAN Han1，REN Guang-xu2，GAO Meng-xiang1，LIU Hong3，WANG Jing2

（1College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou 434025，China;2Institute of Food and Nutrition Development，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100081，China;3 College of Life Science，South-central University for Nationalities，Wuhan 430074，China）

Abstract：Nattokinase is a kind of alkaline serine protease with a strong and direct fibrinolytic activity，has been the focus of development of new antithrombotic agent to prevent cardiovascular disease because of its advantages over conventional drugs in recent decade.The gene cloning，physicochemical properties and biological function of nattokinase were first introduced briefly，then the main studies and progress of recombinant expression of nattokinase by genetic engineering technology including codon optimization，point mutation，efficient expression system and so on were summarized，meanwhile some technical bottlenecks and obstacles to nattokinase industrial production were analyzed.Finally，the application prospect of nattokinase in medicine，food and other industries in the near future was discussed.

Keywords：nattokinase;fibrinolytic activity;recombinant expression strategy;application prospect

（責任编辑 唐建敏）