牛初乳安全性的毒理学研究

赵金鹏 韩超 石丽丽 李岩

摘 要：目的：评价牛初乳的安全性。方法：按照《保健食品检验与评价技术规范（2003版）》进行急性经口毒性试验、Ames试验、骨髓细胞微核试验、精子畸形试验和大鼠30d喂养试验等毒理学安全评价试验。结果：牛初乳大鼠经口急性毒性试验中MTD值>15.0g/kg·BW。小鼠骨髓微核试验、Ames试验、小鼠精子致畸试验对牛初乳样品没有致突变的作用。大鼠30d喂养试验各项指标也均未见明显毒性反应：对照组和各剂量组大鼠的生长发育均未见异常，血液学、血液生化、主要脏器重量、脏器系数均在正常值范围内，组织病理学检查未见与受试物有关的异常改变。结论：牛初乳属于无毒级、不会引起突变，大鼠30d喂养试验各项指标也均未见明显毒性反应。

关键词：牛初乳;安全性评价;毒理学;30d喂养

牛初乳冻干粉是以母牛分娩3d内的初乳采用冷冻干燥工艺制成的一种具有多种保健功能的乳品，富含蛋白质及多种免疫球蛋白、生长因子、碳水化合物、维生素和矿物质等，营养成分比较均衡，并且内含多种生物活性物质和功能因子。现代药理学和动物功能学研究表明，牛初乳冻干粉具有显著提高免疫功能、促进生长发育、抗衰老的多种保健功能[1-3]。最近利用牛初乳研究预防CCl4化学性肝损伤取得良好的效果[4]，同时发现，牛初乳冻干粉具有预防酒精肝损伤的效果[5]，且对睡眠状况具有一定的改善作用[6]。为评价牛初乳的安全性，本研究对牛初乳样品进行了急毒试验、遗传毒性试验、大鼠30d喂养试验，为其安全应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 受试物 牛初乳，某医药科技有限公司提供，内容物为淡黄色至黄色粉末，人体推荐量为0.8g/d。

1.1.2 动物 KM小鼠（SPF级）、SD大鼠（SPF级），生产许可证号：SCXK（军）2012—0004，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。动物饲养实验室为屏障环境，温度20～24℃，相对湿度40 %～70 %，许可证号：SYXK（京）2014—0043。

1.1.3 主要仪器设备 血细胞自动分析仪（sysmex XT-1800i）、全自动生化分析仪（日立7080）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠急性毒性试验 按照最大耐受量法进行。选用SD大鼠20只，雌雄各半，体重为180～220g。受试物用蒸馏水配成浓度为0.25g/mL的溶液。以20.0mL/kg·BW量进行灌胃，1日3次，每次间隔4h，受试物给予剂量为15g/kg·BW。给予牛初乳样品后持续观察14d，记录大鼠有无死亡和中毒表现。

1.2.2 Ames试验 采用标准平板掺入法。设未处理对照、溶剂对照组（蒸馏水）、阳性对照组（阳性物2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、1，8-二羟基蒽醌，敌克松）。设5 个剂量组分别为牛初乳5 000、1 000、200、40、8μg /皿。每种菌（TA97、TA98、TA100、TA102）每个测试浓度设3 个平皿，实验条件是加与不加S-9，并且再同样重复1 次，计回变菌落数。如牛初乳样品的回变菌落数大于对照组的2倍并具有剂量-反应关系，则判为牛初乳样品遗传毒性试验为阳性。

1.2.3 小鼠微核试验 采用间隔1d 2次对小鼠进行经口灌胃法进行试验。雌雄各25 只小鼠，体重25～30g，随机分为5 组，实验采用最大灌胃剂量方法一次性进行剂量设计，牛初乳样品剂量分别为5.00、2.50、1.25g/kg·BW，另设蒸馏水为阴性对照组、环磷酰胺40mg/kg·BW为阳性对照组。按照20.0 mL /kg·BW灌胃，最后一次给样后6h处死动物，将其胸骨骨髓取下进行制片。显微镜下计数每鼠1 000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），记录含有微核的细胞数，统计微核发生率;每只小鼠为200 个嗜多染红细胞，计算成熟红细胞比值（PCE /NBC）与嗜多染红细胞。

1.2.4 小鼠精子致畸试验 雄性小鼠25只，体重为25～35g，随机分为5 组，实验按照一次性最大灌胃剂量方法进行剂量设计，设蒸馏水为阴性对照组、环磷酰胺40.0mg/kg·BW为阳性对照组，受试物剂量分别为5.00、2.50、1.25g/kg·BW。按照20.0mL /kg·BW进行灌胃，1次/d，连续5d。在最后一次给样后的第30天处死小鼠，将两侧附睾取下后进行常规制片、镜检。对每只小鼠结构完整的1 000个精子进行计数，计算精子畸形率并记录畸变数目。

1.2.5 大鼠30d喂养试验 断乳SD大鼠雌雄各40只，随机分为4组，分别为对照组（蒸馏水），牛初乳0.33、0.67、1.34g/kg·BW 组，剂量分別相当于人体推荐摄入量的25 、50 、100 倍。按照大鼠每日100g体重进食10g饲料计算，低、中、高剂量组分别将0.066、0.134、0.268kg的受试物添加至20kg鼠维持饲料中，为消除因添加受试物而导致的各组饲料蛋白质含量的差异，分别将188、142、94g纯度为85%的酪蛋白添加入对照组、低剂量组和中剂量组，以使各组饲料蛋白质含量相同。大鼠自由进食、饮水。每周记录体重、进食量并计算食物利用率。30d后麻醉腹主动脉取血检测血液学检查，包括血红蛋白（HGB）含量、红细胞（RBC）和白细胞（WBC）计数及分类、。血清分离后进行生化检查，包括谷丙转氨酶（ALT）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、谷草转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、甘油三酯（TG）、血糖（GLU）、总胆固醇（CHO）、肌酐（CREA）含量。取每只大鼠的睾丸或卵巢、肝、肾、脾进行称重，计算脏体比并进行脏器初步观察，取高剂量组和对照组的卵巢睾丸、胃、肝、十二指肠、肾、脾对其进行病理学的检查。

1.2.6 数据统计 实验数据采用 SPSS软件进行统计分析，采用泊松分布进行统计分析微核试验的结果，采用χ2检验进行统计分析小鼠精子畸形试验的结果，先对30d喂养试验的数据进行方差齐性的检验，若各组方差性均齐，则采用单因素方差分析法进行总体比较，以α=0.05作为显著性水平，若方差不齐则要调整变量转换原始数据，方差齐性检验合格后，选用转换后的数据进行统计;若方差齐性不能满足，采用其他的统计方法如Brown-Forsythe检验或Welch检验等。

2 结果与分析

2.1 大鼠急性毒性试验

大鼠在观察期内未出现死亡情况、中毒症状，牛初乳急性经口大鼠试验MTD>15.0g/kg·BW（表1），级别为无毒。

2.2 遗传毒性试验

2.2.1 Ames试验 在加与不加S-9的情况下，以8、40、200、1 000、5 000μg/皿的剂量在相同试验条件下重复做2次试验，2次试验中受试物对照组、高中低剂量组均无剂量-反应关系，回变菌落数未超过自发回变菌落数的2倍（表2）。因此，在S-9的加与不加时，不曾见牛初乳对鼠伤寒沙门氏菌的4株试验菌株有致突变作用。

2.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 受试物高中低剂量组PCE与成熟红细胞的比例不少于阴性对照的20%，表明牛初乳样品在实验剂量下无细胞毒性;♂♀阴性对照组的微核发生率明显低于阳性对照组（P<0.01）（表3），而牛初乳样品高中低剂量组的阴性对照组与微核率比较均无显著性差异（P>0.05），说明该受试物不能引起小鼠的骨髓嗜多染红细胞突变作用。

2.2.3 小鼠精子致畸试验 受试物对照组与高中低剂量组小鼠精子畸形率阴性相比无显著性差异（P>0.05）（表4），而阴性对照组与环磷酰胺阳性对照组相比有显著性差异（P<0.01）（表5），说明该受试物不能对小鼠精子产生畸形的作用。

2.3 大鼠30d喂养试验

2.3.1 动物的食物利用率、成长状况 各组动物活动、生长正常。雌性0.33g/kg·BW剂量组大鼠第3周和第4周进食量明显低于对照组（P<0.01），上述数据在本实验室历史对照范围内，认为无生物学意义。除此之外，对照组与高中低剂量组雌雄动物体重、进食量、食物利用率相比均无显著性差异（P>0.05）。

2.3.2 血液学指标和血液生化指标 雄性0.67g/kg·BW剂量组大鼠中性细胞百分比与对照组相比明显升高（P<0.01）、淋巴细胞百分比与对照组相比明显降低（P<0.01）。但在本实验室历史正常对照检测范围内，高中低剂量组间也无剂量-反应关系，认为该差异无生物学意义，其余雌、雄高中低受试物剂量组的血常规指标与对照组相比均无显著性差异（P>0.05）（表6）。雌性1.34g/kg·BW剂量组大鼠AST明显低于对照组（P<0.01），该指标的降低无生物学意义。雄性0.67g/kg·BW剂量组ALT明显高于对照组（P<0.05），但在本实验室历史正常对照检测范围内，认为该差异无生物学意义。其余雌雄高中低剂量组血生化指标与对照组相比均无显著性差异（P>0.05）（表7～8）。

2.3.3 组织病理学观察及大体解剖 大体检查对照组和高中低实验计量组各脏器未见异常，对照组与高中低剂量组大鼠脏器重量和脏器系数相比无显著性差异（P>0.05）。有个别动物在组织病理检查中出现肝细胞灶状样坏死（对照组0/20例、高剂量组1/20例）、肝细胞点状坏死（对照组1/20例、高剂量组2/20例）和肾盂扩张（对照组1/20例、高剂量组0/20例）。上述肝脏和肾脏病理学改变是动物自身常见病变，且高剂量组和与对照组无明显差异，确定受试物与此无关。卵巢、脾、胃肠、睾丸等脏器未见明显异常。综上认为，牛初乳未引起有意义的病理改变。

3 讨论

牛初乳内含的多种活性成分与酶类（如超氧化物歧化酶SOD）等具有抑制脂质过氧化、调节体内正常代谢功能。牛初乳在本次实验的毒理学食物评价结果中显示，牛初乳对♀♂大鼠急性毒性试验中的MTD值均>15.0g/kg·BW。急性毒性分级标准中可以明确看出，牛初乳属于无毒级。小鼠精子畸形试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验均未发现牛初乳有致突变作用。以0.33、1.67、1.34g/kg·BW剂量的牛初乳掺料给予大鼠30d，各组动物生长发育良好，体重增加正常、组织病理学检查、血生化及血液学检查均未见与牛初乳样品有关的异常。本实验结果提示，保健食品牛初乳是安全的，该实验为进一步开发应用牛初乳提供了毒理学方面的依據。

参考文献

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Safety Evaluation on Cow Colostrum

ZHAO Jin-peng，HAN Chao，SHI Li-li，LI Yan

（National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China）

Abstract：ObjectiveTo evaluate the toxicology safety of cow colostrum.MethodAcute oral toxicity test，genetic toxicity test and 30 days oral toxicity test were conducted according to technical guidlines of inspection and evaluation for health food.ResultMID of acute oral toxicity test for cow colostrum was greater than 15.0g/kg·BW.No mutation effects were induced in Ames test，bone marrow cell micronucleus test in mice，and sperm abnormality test in mice.For the 30 days oral toxicity test，the parameters including growth and development，hematology，biochemistry，main organ weight and organ weight ratio were in the range of normal value，and no abnormality related to the cow colostrum was induced in the histopathology.ConclusionNo obvious toxicity was induced in cow colostrum.

Keywords：cow colostrum;safety evaluation;toxicology;30d oral toxicity test

（責任编辑 唐建敏）