3种三七根腐病致病菌的抑菌植物筛选

李纪潮 杨天梅 杨绍兵 左应梅 杨美权 章朦玥 许宗亮 张金渝

摘要：【目的】篩选出对3种三七根腐病致病菌具有强抑菌效果的拮抗植物，为制定三七根腐病绿色安全的防控措施提供科学依据。【方法】针对三七根腐病的3种致病菌[假单胞杆菌属（Pseudomonas sp.，菌株号B857）、无色杆菌（Achromobacter marplatensis，菌株号B562）和产碱菌属（Candidimonas sp.，菌株号B2681）]，选用16种常见草本植物进行乙醇超声波提取，用二倍稀释法稀释成5个浓度梯度进行平板打孔抑菌试验，测量抑菌直径并计算毒力回归方程及致死中浓度（LC50），采用刃天青微孔板法观测16种植物提取液对3种病原菌的最小抑菌浓度（MIC），筛选出抑菌效果强的植物进行田间三七苗覆盖试验，观测其对三七出苗及农艺性状的影响。【结果】毒力测定结果显示，大狼毒对3种病原菌均非常敏感，LC50均小于0.100 g/mL;紫茎泽兰和黄花蒿对B857和B562非常敏感，LC50均小于0.100 g/mL;苦蒿、艾草和万寿菊对B857非常敏感，鬼针草对B562非常敏感，LC50均小于0.100 g/mL。MIC测定结果表明，万寿菊、苦蒿和紫茎泽兰对3种病原菌的抑菌效果较强，其中，万寿菊对3种病原菌的综合效果最强，对B562和B2681的MIC低至1.875 mg/mL，对B857的MIC为3.750 mg/mL;苦蒿对B857和B562的MIC为1.875 mg/mL;紫茎泽兰对B2681的MIC为1.875 mg/mL，对B562和B857的MIC为3.750 mg/mL。田间化感作用试验结果表明，万寿菊覆盖方式的三七出苗率最高，为75.86%，苦蒿覆盖方式的出苗率最低，为65.43%;3种植物覆盖方式对三七茎粗、叶长和叶面积无显著影响（P>0.05），对三七苗株高有显著促进作用（P<0.05，下同）。万寿菊和苦蒿覆盖方式致使三七苗叶宽变窄，且与对照差异显著。【结论】万寿菊和紫茎泽兰对3种三七根腐病致病菌的综合抑菌效果较强，且对三七生长无显著化感作用，万寿菊可直接采收后作为覆盖物返田利用，紫茎泽兰需烘干打粉后施用。刃天青微孔板法可作为植物源提取物最小抑菌浓度的测定方法。

关键词： 三七根腐病;致病菌;毒力测定;抑菌植物筛选;刃天青微孔板法

中图分类号： S435.672                    文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）10-2205-09

Antibacterial plant screening of three pathogenic bacteria

of notoginseng root rot

LI Ji-chao1， YANG Tian-mei1， YANG Shao-bing1， ZUO Ying-mei1， YANG Mei-quan1，ZHANG Meng-yue2， XU Zong-liang1， ZHANG Jin-yu1*

（1Institute of Medicinal Plant， Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming  650231， China; 2School of Life Science and Biopharmaceutics， Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang  110021， China）

Abstract：【Objective】Screening antagonistic plants with strong antiseptic effects on the three pathogenic bacteria of notoginseng root rot， and providing a scientific basis for the development of safe control and control practices for notoginseng root rot. 【Method】For notoginseng root rot three pathogenic bacteria[Pseudomonas sp.（strain No.B857）， Achromobacter marplatensis（strain No.B562）， Candidimonas sp. （strain No.B2681）]， 16 common herbs were selected for ethanol ultrasonic extraction. The anti-bacterial diameter was measured and the virulence regression equation and median lethal concentration（LC50） were calculated by diluting the five concentration gradients with twice dilution method for plate perforation bacteriostatic experiment. The minimum bacteriostatic concentration（MIC） of 16 plants on pathogenic bacteria was observed by Resazurin microporous plate method microporous plate method. The plants with strong bacteriostatic effect were screened for field mulch experiments to observe the effects on notoginseng seedlings and agronomic traits. 【Result】The toxicity results showed that Euphorbia jolkinii Boiss. was very sensitive to all three pathogenic bacteria， and the LC50 was less than 0.100 g/mL. Eupatorium coelestinum L. and Artemisia annua L. were very sensitive to B857 and B562， and the LC50 was less than 0.100 g/mL. In addition， Artemisia lavandulaefolia DC.， Artemisia argyi H. Levl. et Vant. and Tagetes erecta L. were very sensitive to B857， and Bidens pilosa L. was very sensitive to B562， with LC50 less than 0.100 g/mL. The MIC showed that T. erecta， A. lavandulaefolia  and E. coelestinum  had the strongest bacteriostatic effects against three pathogenic bacteria. T. erecta had the strongest comprehensive bacteriostatic effect on three pathogenic bacteria， the MIC to B562 and B2681 was as low as 1.875 mg/mL， and the MIC to B857 was 3.750 mg/mL.MIC of A. lavandulaefolia to B857 and B562 was 1.875 mg/mL. MIC of E. coelestinum to B2681 was 1.875 mg/mL， and the MIC to B562 and B857 was 3.750 mg/mL. The results of the field-based effect test showed that T. erecta  had the highest emergence rate at 75.86% and A. lavandulaefolia had the lowest emergence rate at 65.43%. The three treatments had no significant effect on the stem diameter， leaf length and leaf area（P>0.05） and the plant height was significantly promoted（P<0.05， the same below）. T. erecta and A. lavandulaefolia treatment made the leaf width smaller but was not significantly different from the control. 【Conclusion】T. erecta and E. coelestinum have the strongest antibacterial effect on the three pathogenic bacteria of notoginseng root rot， and have no significant allelopathy effect on notoginseng growth. T. erecta can be directly harvested as mulch return field utilization， E. coelestinum need to be made into dry powder before application. The Resazurin microporous plate method microporous plate method can be used as a method for the determination of the minimum bacteriostatic concentration of plant source extracts.

Key words： root rot of notoginseng; pathogenic bacteria; virulence determination; bacteriostatic plant screening; Resazurin microporous plate method

0 引言

【研究意义】三七[Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen]为五加科人参属植物，《本草纲目拾遗》中记载，人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药中之最珍贵者（Guo et al.，2010）。近年来，因其治疗范围广泛且疗效显著，市场需求量增加，种植面积扩大，随之根腐病问题日益严重，而三七的主要药用部位为根系，根腐病对三七而言为毁灭性病害，严重者可损失70%以上，甚至绝收，造成三七产量和品质降低（缪作清等，2006）。目前三七根腐病防治主要采用化学农药，但化学农药的大量使用易导致“3R”问题（Pang et al.，2012）。植物源杀菌剂来自天然植物资源宝库，具有选择性高、环境友好、对非靶标生物安全、低毒、低残留、促进作物生长及提高作物抗病性等特点，满足绿色防控及安全可持续理念的要求（Xiong et al.，2016）。因此，筛选对三七根腐病病原菌的抑菌拮抗植物，对三七根腐病植物源杀菌剂的开发及推广绿色防控栽培技术具有重要意义。【前人研究进展】研究发现，三七根腐病中假单胞杆菌属细菌的致病性最强，较真菌属常见致病源腐皮廉孢（Fusarium solani）和细链格孢（Alternaria tenuissima）的致病力更强（罗文富等，1997）;假单胞杆菌属细菌发病后期与土壤习居菌如镰刀菌、丝核菌等复合侵染，导致根腐病传播加重（Lei et al.，2017），因此，抑制病原微生物的生长在缓解三七根腐病的暴发中起着关键作用。目前关于植物源抑菌作用的研究已有较多报道，万寿菊提取液（王宪青等，2008）、紫茎泽兰提取物（池水晶等，2013）和黄花蒿残膏挥发油（江晓波等，2015）对大肠杆菌均有抑制作用，可造成细胞膜破裂，或空腔化;铁苋菜叶和树皮提取物对沙门氏菌具有抗菌活性（Bahiense et al.，2017）;肉桂提取物对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜的形成具有抑制作用（綦国红等，2018）;香合欢（Banothu et al.，2017）和荨麻叶（Mzid et al.，2017）活性物质可抑制铜绿假单胞菌的生长;牡丹花蕾提取物对铜绿假单胞菌有显著抑制作用，可改变膜脂肪酸组成和膜蛋白构象并破坏膜完整性（周云冬等，2019）。【本研究切入点】变形菌门（Proteobacteria）是三七连作过程中的优势细菌门（Dong et al.，2016;Fan et al.，2016），假单胞杆菌、无色杆菌和产碱菌为三七根腐病的主要病原细菌，目前针对这3种病原菌的抑菌研究及拮抗植物筛选尚未见报道。【拟解决的关键问题】选取云南常见的16种杂草，通过乙醇超声法提取粗提物，以假单胞杆菌属（Pseudomonas sp.）、无色杆菌（Achromobacter marplatensis）和产碱菌属（Candidimonas sp.）3种病原细菌为目标菌，采用平板打孔法和刃天青微孔板法研究植物提取物对3种病原菌的抑菌效果，并通过田间覆盖试验观测植物干粉对三七苗生长及化感作用的影响，筛选出对三七根腐病具有强抑菌作用的拮抗植物，为三七根腐病的植物源杀菌剂开发提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的3种三七根腐病病原细菌[假单胞杆菌属（Pseudomonas sp.，菌株号B857）、无色杆菌（A. marplatensis，菌株号B562）和产碱菌属（Candidimonas sp.，菌株号B2681）]均由沈阳药科大学鉴定提供。供试16种草本植物目录见表1。NA培养基配方：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL、pH 7.2。刃天青染色剂：将刃天青钠盐在无菌条件下用无菌水配制成 0.1 g/L的溶液，现配现用。主要仪器设备：BJ-800A粉碎机（德清拜杰电器有限公司）、GR60DA电热压力蒸汽灭菌锅[致微（厦门）仪器有限公司]、SW-CJ-1FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、DHP-9051微生物培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、N-1100旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）、LANYI-1000CT超声波提取机（上海兰仪实业有限公司）、HGPF-9162（GPX-9162）电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）、THZ-052D双层恒温摇床（上海博彩生物科技有限公司）、UGTY-1200冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）、UV-2100型紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）和HM-G10叶面积指数测定仪（山东恒美电子科技有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 提取液制备 将采集的植物材料进行清理，去除泥土、坏死的老叶、缠绕物及其他异物，置避光通风处自然陰干，于电热恒温干燥箱中50 ℃烘干。植物样品提取参考姬妍茹等（2014）的方法：用粉碎机将植物粉碎，过40目筛，称取300 g样品粉末，倒入500 mL三角瓶内，加入500 mL 95%乙醇溶液，静置7 d，超声波提取30 min，重复3次;用乙醇冲洗滤渣3次，合并滤液，70 ℃旋转蒸发至体积不再变化，得到提取物浸膏，浸膏用50%丙酮和5%吐温-80混合液溶解，稀释至浓度为0.6 g/mL的母液，置于4 ℃冰箱保存备用。

1. 2. 2 菌悬液制备 将细菌在培养基上活化，于抑菌活性试验前12 h继代培养一次，保证细菌的生长能力达最强状态。无菌条件下吸取1 mL含有细菌菌株的NA培养基于离心管中，6000 r/min下离心5 min，弃上清液，吸取适量的NaCl（0.9%）生理盐水于离心管中，轻轻振荡，制备菌悬液。使用分光光度计测定菌悬液的OD，设定分光光度计的紫外波长为600，选择OD600为0.08～0.10的菌液，此时菌悬液浓度约为108 CFU/mL。

1. 2. 3 抑菌圈直径测定 以平板打孔法进行抑菌直径测定。在无菌条件下每个培养皿中倒入15 mL培养基，厚度5 mm，待培养基凝固后，用无菌金属打孔器（d=6 mm）打成直径6 mm、深5 mm的4个小孔，除去孔内琼脂，并用微量移液枪在小孔内打入50 μL琼脂进行封底。采用涂布法将细菌菌悬液涂布于培养基平面。用二倍稀释法将0.6 g/mL母液提取液稀释成0.6000、0.3000、0.1500、0.0750和0.0375 g/mL 5个浓度梯度，各浓度吸取200 μL提取液分别加入到培养基的4个小孔中，将培养皿置于（25±2）℃恒温箱中培养24 h后取出观察结果，每处理3次重复，测量抑菌圈的直径并记录，取平均值。

1. 2. 4 最低抑菌浓度（MIC）测定 参考袁高庆等（2011）采用刃天青法测定MIC。取24孔板，每个小孔中加入400 μL的NA液体培养基，分别加入浓度为0.3000、0.1500、0.0750、0.0375、0.0188和0.0094 g/mL的提取液100 μL，最终配制为30.000、15.000、7.500、3.750、1.875和0.938 mg/mL共6个梯度的含药培养基。待凝固后加入100 μL菌悬液，分别用不含药培养基加入无菌水、菌悬液作为对照，在（25±2）℃恒温培养箱培养24 h，向所有孔内加入0.1 g/L的刃天青溶液100 μL，（25±2）℃恒温孵育4 h，每处理3次重复，显色后观察结果，变为红紫色和红色判断为无抑菌效果，不变色的最小浓度为MIC。

1. 2. 5 拮抗植物对田间三七出苗及农艺性状的影响 筛选出抑菌效果强的拮抗植物，烘干打粉后覆盖于三七苗床表面，设置面积相等的3个小区，播种量一致，以不加拮抗植物的小区为对照，观测其化感作用对三七出苗及农艺性状的影响。随机划线30 cm×30 cm的样方进行出苗株数统计，换算成出苗率;每小区统计30株三七小苗的株高、茎粗、叶长和叶宽，用游标卡尺测量;使用叶面积指数测定仪进行叶面积测定。

1. 3 统计分析

试验数据运用SPSS 20.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），农艺性状数据以<d：＼飞飞翔＼plugins＼v12pluginwordtranslator＼wordimage＼NF19-0968《三七根腐病3种致病细菌的抑菌植物筛选研究》_修改稿-60B＼image1.pdf>表示，用Duncan’s新复极差法进行数据差异显著性检验（α=0.01），用PROBIT回归分析进行毒力回归方程、致死中浓度（LC50）和决定系数（R2）计算，用Excel 2017制表。

2 结果与分析

2. 1 16种植物提取液对三七根腐病病原菌的毒力测定结果

2. 1. 1 16种植物提取液对假单胞杆菌B857的毒力测定结果 由表2可知，黄花蒿、大狼毒、紫茎泽兰、苦蒿、艾草和曼陀罗对B857非常敏感，LC50均小于0.100 g/mL;土荆芥、大蓟和金荞麦对B857的敏感性较差，其LC50均大于1.000 g/mL;紫苏对B857无抑菌作用。表2结果顯示黄花蒿R2为0.990，表明抑菌浓度与抑菌作用间呈显著线性关系，随提取液浓度增加抑菌作用增强。

2. 1. 2 16种植物提取液对无色杆菌B562的毒力测定结果 由表3可知，大狼毒、紫茎泽兰、鬼针草、黄花蒿和万寿菊对B562非常敏感，LC50均小于0.120 g/mL;曼陀罗、金荞麦、波斯菊和土荆芥对B562不敏感，其LC50均大于0.400 g/mL;土大黄、蓖麻和三分三对B562无抑制作用。表3结果显示万寿菊R2为0.996，表明抑菌浓度与抑菌作用间呈显著线性关系，随提取液浓度增加抑菌作用增强。

2. 1. 3 16种植物提取液对产碱菌B2681的毒力测定结果 由表4可知，大狼毒对B2681非常敏感，LC50为0.089 g/mL，小于0.100 g/mL;黄花蒿、万寿菊和紫茎泽兰抑菌效果次之，LC50均小于0.200 g/mL;土大黄、紫苏和金荞麦对B2681无抑制作用。表4结果显示黄花蒿R2为0.994，表明抑菌浓度与抑菌作用间呈显著线性关系，随提取液浓度增加抑菌作用增强。

2. 2 16种植物提取液对3种病原菌的MIC

2. 2. 1 16种植物提取液对假单胞杆菌B857的MIC

表5结果显示，苦蒿对B857的MIC为1.875 mg/mL，抑菌效果最强;紫茎泽兰、土大黄、大狼毒、万寿菊和黄花蒿对B857的抑菌效果次之，MIC为3.750 mg/mL;鬼针草、艾草、金荞麦和波斯菊对B857的抑菌效果较弱，MIC为15.000 mg/mL。

2. 2. 2 16种植物提取液对无色杆菌B562的MIC

表6结果显示，苦蒿、艾草和万寿菊对B562的抑菌作用最强，MIC为1.875 mg/mL;紫茎泽兰的抑菌效果次之，MIC为3.750 mg/mL;土大黄、蓖麻、鬼针草、紫苏、三分三和大蓟对B562的抑菌效果最弱，MIC均大于30.000 mg/mL。

2. 2. 3 16种植物提取液对产碱菌B2681的MIC

表7结果显示，紫茎泽兰和万寿菊对B2681的抑菌效果最强，MIC为1.875 mg/mL;蓖麻、苦蒿和大蓟对B2681的抑菌效果次之，MIC为7.500 mg/mL;土大黄、鬼针草、紫苏、金荞麦和波斯菊对B2681的抑菌效果较弱，MIC均大于30.000 mg/mL。

2. 3 田间化感作用试验结果

综合16种植物提取液对三七根腐病病原菌的MIC，紫茎泽兰、苦蒿和万寿菊对三七根腐病病原菌的综合抑菌效果较强。采收紫茎泽兰、苦蒿和万寿菊烘干打粉后覆盖于三七苗床表面，观察3种植物处理对三七出苗及农艺性状的影响，结果（表8）表明，万寿菊覆盖方式的三七出苗率最高，为75.86%，而苦蒿覆盖方式影响了三七出苗，出苗率最低，为65.43%，且与万寿菊覆盖方式差异显著（P<0.05，下同）;3种植物覆盖方式对三七茎粗、叶长和叶面积无显著影响（P>0.05）;3种植物覆盖方式对三七苗株高有显著促进作用，其中，万寿菊覆盖方式的三七株高显著高于其他植物覆盖方式;万寿菊和苦蒿覆盖方式致使三七苗叶宽变窄，且与对照差异显著。综上所述，万寿菊和紫茎泽兰对三七生长无抑制的化感作用，可作为三七田间覆盖物施用，能促进三七出苗且不影响其农艺性状，对三七根腐病病原菌也有较强的抑制作用。

3 讨论

天然植物在漫长的进化过程中合成了许多结构复杂新颖的次生代谢产物，在抗癌、抗菌等方面显示出巨大潜力（王婧等，2018）。云南省植物资源丰富，就近选择廉价、易得的常见草本植物在三七根腐病防控中加以利用，具有一定的生态、社会和经济意义。本研究中，万寿菊对3种三七根腐病致病菌的综合抑菌效果最强，对无色杆菌B562和产碱菌B2681的MIC低至1.875 mg/mL，对B857的MIC为3.750 mg/mL，同时显著提高三七的出苗率和株高，具有较高的应用潜力。前人研究显示，万寿菊提取物具有广谱杀灭病原菌的活性（Saani et al.，2018），对革兰氏阴性菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有较强的抑制作用（王宪青等，2008）。目前，对万寿菊的抑菌活性成分以叶黄素研究最多，主要是α-三连噻吩及其衍生物，对大肠杆菌和青霉菌的抑制效果明显（李曼，2014）;另外，5种生物碱（刘佳斌等，2007）、7种黄酮类（刘佳斌等，2008）和精油类（范志宏等，2011）成分对西瓜枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用，可使病菌的果胶酶活性降低，呼吸强度提高，细胞膜通透性增大。万寿菊对三七根腐病也有较好的生防潜力，其根部提取物抑菌活性最强，可使镰刀菌酸（FA）发生钝化，体内抗氧化保护酶提高（范志宏等，2010），其杀菌素水乳剂可产生降解尖孢镰刀菌细胞壁的酶类，使侵染活性下降，从而起到抑菌和保护植物的作用（孙芬变和王金胜，2012）。 因此，万寿菊可作为三七根腐病绿色防治的植物源应用推广，可直接采收后作为田间覆盖物使用，或制成提取液浇灌苗床用于根腐病防治，或加入连作土中作为降低病原菌的土壤调理剂使用。

苦蒿和黄花蒿属于菊科蒿属，本研究中苦蒿抑菌作用较强，对B857的毒力较高，对B857和B562的MIC低至1.875 mg/mL。前人研究表明，苦蒿对革兰氏阳性菌有较好的抑制效果（王寅生等，2019），自然条件下蒿属植物通过茎叶挥发和淋溶、土壤残体腐解和根系分泌等方式向环境中释放化感物质，进而抑制微生物的生长繁殖（赵雅萌等，2018）。但本研究的田间试验发现苦蒿降低了三七的出苗率，对三七的生长造成影响，可进一步研究其抑菌成分，为植物源杀菌剂产品开发提供理论参考。

本研究中，紫茎泽兰对B857和B562的毒力最高，LC50均小于0.030 g/mL;对B2681的MIC为1.875 mg/mL，对B857和B562的MIC为3.750 mg/mL。Sachin等（2010）、Aditi等（2013）研究表明，紫茎泽兰提取物具有广谱杀灭病原菌的活性，但紫茎泽兰作为入侵物种，其根、茎和种子皆可再生繁殖，不能直接返田使用，本研究将紫茎泽兰烘干打粉后施用，对三七生长无显著抑制作用，可作为三七根腐病的田间覆盖物推广应用。紫茎泽兰的倍半萜类是研究最多的抑菌物质，杜松-3-烯-2，7-二酮等对立枯絲核菌有很强的抑菌效果（Kundu et al.，2013），9-羰基-10Hβ泽兰酮和9-羰基-10，11去氢泽兰酮加速了链格孢菌和腐皮镰孢菌菌丝和分生孢子的衰老凋亡，破坏卵菌细胞壁和细胞膜的完整性，造成细胞器解体，DNA聚合酶的活性下降影响病原菌细胞内部代谢和自我基因的复制（Liu et al.，2016）。因此，紫茎泽兰的化学组分在抑菌作用上有巨大潜力，可开发为植物源杀菌剂进行间接利用，兼顾对入侵杂草的科学防除，具有较高的生态效益。

刃天青（Resazurin）是非荧光染料，在活细胞的多种还原酶作用下可将蓝色的刃天青还原成粉红色的荧光染料——试卤灵（Resorufin）。本研究在预试验中试用了标准MH液体稀释法、平板划线培养法和活菌计数法，由于植物源提取物颜色深，较多呈墨绿色，因而对需要观测的液体稀释法和活菌计数法使用受限。刃天青微孔板显色法是利用活细胞线粒体酶可将蓝色刃天青还原为粉红色的原理，通过简单的颜色区别来判定MIC终点，该方法具有以下优点：（1）简便节约，提取物用量仅需100 μL;（2）准确，排除了人为计数主观因素干扰;（3）快速，仅需4 h孵育得出结果;（4）灵敏，对低浓度菌液也能快速显色。本研究显示，刃天青微孔板法可清晰辨别最小抑菌浓度，避免了提取物颜色深难辨别的难题，可作为植物源提取物最小抑菌浓度的最佳测定方法。

4 结论

万寿菊和紫茎泽兰对3种三七根腐病致病菌的综合抑菌效果较强，且对三七生长无显著的化感作用，可作为三七根腐病绿色防治的植物源推广应用，其中，万寿菊可直接采收后作为覆盖物返田利用，紫茎泽兰需烘干打粉后施用。刃天青微孔板法可作为植物源提取物最小抑菌浓度的测定方法。

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（責任编辑 麻小燕）