斑马鱼对铜、铅和镍的生物富集动力学研究

甘露菁 荣菡 杨丹 王磊

摘 要：以斑马鱼为实验对象，应用双箱动力学模型模拟了其暴露在不同浓度的3种重金属（Cu、Pb、Ni）养殖水中，考察其在富集与排出过程中的生物富集规律，利用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对斑马鱼体内重金属含量进行动态监测，并对结果进行非线性拟合，得到斑马鱼富集重金属的动力学参数。对模型拟合度检验表明双箱动力学模型拟合程度良好，可用于描述Cu、Pb和Ni在斑马鱼体内的生物富集规律。结果表明：斑马鱼对水中重金属的富集能力与暴露浓度呈正相关，而其对不同重金属的富集具有选择性，对3种重金属生物富集能力由强到弱排序为Cu>Pb>Ni，其中斑马鱼对Cu的富集能力极强。此外，斑马鱼对3种重金属的排出速率系数与生物半衰期均与暴露浓度无明显相关性，不同种类的重金属在斑马鱼体内的生物半衰期按时间长短排序为Ni>Pb>Cu，但排出阶段结束后，斑马鱼体内的重金属浓度依然高于初始浓度数倍甚至数十倍。

关键词：斑马鱼;生物富集动力学;铜;铅;镍

近年来，我国水体重金属污染问题十分突出，大量的重金属元素排放至地表径流进入水生生态环境[1]，影响水生生物食品安全性[2-4]，人类食用重金属超标的水生生物后会造成不同程度的急性或慢性中毒现象[5]。斑马鱼因具有时代周期短、产卵多且受精卵容易观察等优点，被很多学者当做受试生物用在重金属对水生生物的毒性作用研究中。如李淑琼等[6]采用斑马鱼为试验生物，进行了静态方式的急性毒性试验，获得了Zn、Cr、Cd的12 h半致死浓度。李汝等[7]将斑马鱼的运动行为学与水质环境监测相结合，实现了生物鱼运动学指标监测水质变化的目标。但目前将斑马鱼用在对重金属污染的生物作用过程研究较为少见，尤其是缺乏富集动力学方面的研究，使得人们对重金属在鱼类体内富集的动力学特征缺乏系统的认识。双箱动力学作为一种数学模型，普遍用于重金属的生物富集研究，如贻贝[ 8-9]、牡蛎[10]、浒苔[11]等。本研究以斑马鱼作为研究对象，运用双箱动力学模型研究铜（Cu）、铅（Pb）和镍（Ni）3种重金属在不同浓度下在其体内的生物富集动力学特性，以提高对其动力学特性的系统认识，对斑马鱼用于重金属预测提供科学依据，也可为鱼类富集重金属的食用安全研究提供支撑。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

斑马鱼，购于珠海市拱北花鸟鱼市场，体质量0.35±0.08g。实验前对斑马鱼进行驯养[12]，时间为7d，期间维持自然光照周期，养殖水温27±1℃，pH值7.0±0.5，溶解氧不低于5.0mg/L，自来水充分曝气24h作为培养用水，饲喂鱼专用全价颗粒料，购自青岛海洋大学饲料厂。实验期间亦保持此饲养条件。Cu、Pb、Ni标准溶液（1 000mg/L），购自国家标准物质中心，ICP-MS调谐液，由Perkin Elmer原装进口，浓硝酸为优级纯，天津大茂，水为超纯水，所用容量瓶使用前均经20%硝酸浸泡3d。

1.2 仪器与设备

ELAN DRC-e电感耦合等离子体质谱仪，美国Perkin Elmer公司;Mars5微波消解仪，美国CEM公司;Mili-Q超纯水仪，美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集 参考GB 11607—1989《国家渔业水质标准》对Cu、Pb和Ni含量的规定设计暴露浓度。实验按照Cu、Pb和Ni暴露浓度分为4组，即空白对照组（Cu、Pb和Ni的浓度为0）、低剂量组（Cu、Pb和Ni的浓度均为10μg/L）、中剂量组（Cu、Pb和Ni的浓度均为50μg/L）、高剂量组（Cu、Pb和Ni的浓度均为100μg/L）。斑马鱼置于100L聚乙烯水箱中，每组水箱中加入60L含有不同浓度Cu、Pb和Ni的复合溶液。每个水箱中放入斑马鱼300只，进行重金属的富集。实验采用半静态的方法，每天换 1 次同种浓度的实验用水，以保持水体中重金属浓度恒定。富集实验时间为20d，取样间隔为4h、12h、1d、2d、4d、6d、8d、12d、20d，每次随机取10条斑马鱼进行分析，采集的鱼样用蒸馏水冲洗后，整鱼匀浆后冷冻，备分析。富集实验结束后即进行排出实验，将剩下的斑马鱼置于另一批100L水箱中，4组均不再向水中加入重金属，排出阶段为20d，取样间隔为1、2、4、6、8、12、20d，采样方法同上。

1.3.2 样品制备与分析 准确称取匀浆后的斑马鱼样品0.5g置于微波消解罐中，加硝酸6mL后，置于已设定好程序的微波工作站中进行消解，升温程序为3 min 升溫至 120 ℃保持 3 min，2 min升温至 150 ℃保持 3 min，2 min 升温至 200 ℃保持 12 min[13]。

ICP-MS操作参数：等离子体气流量：15L/min;射频功率：1 100W，雾化室温度：2 ℃;雾化器流量：0.89L/min;辅助气流量：1.2L/min，蠕动泵转速：24r/min;离子透镜电压：10V;数据采样模式：跳峰采集模式;采样深度：10 mm;重复次数：3 次;扫描次数：100 次。

1.3.3 实验应用模型 目前重金属在生物体和水体之间的作用过程多用两相分配模型中的双箱动力学模型进行描述[14]。重金属在生物体内的富集通常可看作是重金属在生物体与水相之间的两相间的分配过程，则富集及释放过程可用一级动力学过程对其进行描述（图1）。

其中，含有重金属污染物的水体作为第一相，生物体作为第二相，那么水体相中重金属浓度的变化为：

而生物体相中重金属的浓度变化为：

式（2）中，C-W为水体相中重金属污染物的浓度（μg/L）;C-A为生物体相中重金属污染物的浓度（μg/kg）;t为实验进行的时间（d）;K-1为生物吸收速率常数;K-2为生物排出速率常数;K-M为生物代谢速率常数;K-V为重金属污染物挥发速率常数。由于本实验中重金属在体内难以挥发，且短时间内在斑马鱼体内的代谢影响基本可以忽略，故可将K-M和K-V视为零。因此，由式（1）～（2）推导可得斑马鱼对重金属的富集和排出方程[15]：

式（4）中，t*为富集阶段的实验天数（d），本研究中为20d;C-0为实验开始前生物体内原本含有的重金属污染物浓度（μg/kg）。

根据式（3）～（4），对监测所得重金属浓度数据进行非线性拟合得到K-1 和K-2值。那么在理论平衡状态下，可求得生物富集系数（bioconcentration factors，BCF）：

重金属的生物学半衰期，即生物体排出一半体内的重金属所需要的时间：

亦可通过模型计算出生物富集达到理论平衡时，体内重金属的最大含量C-Amax：

1.4 數据分析

所得数据用Excel 2010及Origin 8.0进行模型拟合与分析。通过卡方检验结合判定系数R2来评价该模型的拟合度，验证双箱模型用于斑马鱼对重金属Cu、Pb、Ni的生物富集研究可行性。

2 结果与分析

2.1 3种重金属在斑马鱼体内的富集与排出规律

由图2可知，富集阶段Cu在斑马鱼体内的富集量与对照组相比都有明显升高，且都与富集时间、暴露质量浓度呈正相关。富集时间结束时（20d），斑马鱼对3种不同质量浓度的Cu富集均未达到平衡，但富集量已分别达到初始浓度的8.9（10μg/L暴露质量浓度）、18.5（50μg/L暴露质量浓度）、28.2倍（100μg/L暴露质量浓度）。

在排出阶段，Cu在斑马鱼体内的富集量明显随着排出时间的延长逐渐降低，并在排出阶段的第8天后趋于平缓。但实验结束时，体内的Cu浓度依然是初始浓度的4～16倍。

由图3可知，与Cu相似，富集阶段Pb在斑马鱼体内的富集量与对照组相比都有明显升高，且都与富集时间、暴露质量浓度呈正相关。富集时间结束时（20d），斑马鱼对3种不同质量浓度的Pb富集均未达到平衡，但富集量已分别达到初始浓度的16.1（10μg/L暴露质量浓度）、21.7（50μg/L暴露质量浓度）、29.0倍（100μg/L暴露质量浓度）。在排出阶段，Pb在斑马鱼体内的富集量随着排出时间的延长明显减少，并在排出阶段的第8天后减少幅度趋于平缓。40d实验结束时，体内的Pb浓度依然是初始浓度的9.8～19.3倍。

由图4可知，与前两种重金属相似，富集阶段Ni在斑马鱼体内的富集量与对照组相比都有明显升高，且都与富集时间、暴露质量浓度呈正相关。富集时间结束时（20d），斑马鱼对3种不同质量浓度的Ni富集均未达到平衡，但富集量已分别达到初始浓度的6.0（10μg/L暴露质量浓度）、10.3（50μg/L暴露质量浓度）、14.6倍（100μg/L暴露质量浓度）。在排出阶段，Ni在斑马鱼体内的富集量明显随着排出时间的延长逐渐降低，但实验结束时，体内的Ni浓度依然是初始浓度的2.7～7.7倍。

2.2 3种金属在斑马鱼体内的生物富集动力学参数

对图2～4的数据进行非线性拟合，得到吸收速率常数K-1、排出速率常数K-2，再根据式（5）～（7）得到斑马鱼对3种重金属生物富集的其他动力学参数BCF、体内理论平衡最大浓度（C-Amax）和生物半衰期（附表）。

由附表可见，斑马鱼对3种重金属Cu、Pb和Ni的K-1、BCF、C-Amax基本随着重金属暴露浓度增大而增大，而K-2则与暴露浓度无明显相关性。BCF描述的是生物对污染物的富集能力，对比可知，斑马鱼对3种不同重金属的富集能力排序为Cu>Pb>Ni，其中对Cu的富集能力极强，此富集能力排序与Lim等[16]的研究相似。生物半衰期描述的是生物排出体内污染物的能力，由附表可见，暴露浓度对排出时间基本没有影响，但是不同种类的重金属在斑马鱼体内不同，其排序为Ni>Pb>Cu，其中Ni的平均为32.5d、Pb的为15.9d、Cu的为12.9d。由此可见，斑马鱼对Cu的富集能力较强，但排出速度也较快，而其对Ni的富集能力较弱，但排出亦慢。

从附表可以看出，3种重金属不同浓度下的回归方程都达到极显著水平（P<0.001），相关系数R2都在0.9以上，可见此模型拟合程度良好，可用于描述Cu、Pb、Ni在斑马鱼体内的富集与排出规律。

3 结论

本研究通过模拟斑马鱼养殖环境，使其分别暴露在重金属Cu、Pb和Ni浓度分别为10、50、100μg/L的养殖水中，通过在不同时间测定斑马鱼体内重金属的浓度变化，研究斑马鱼对3种重金属的富集规律。研究分为富集阶段与排出阶段，在富集阶段中，斑马鱼对水中重金属的富集能力随着暴露浓度增加而增加，而其对不同重金属的富集具有选择性，3种重金属中，斑马鱼对Cu的富集能力极强，其C-Amax最高可达1.8×106μg/kg，BCF最高可达1.8×104。斑马鱼对3种重金属生物富集能力由强到弱排序为Cu>Pb>Ni。在排出阶段中，斑马鱼对3种重金属的排出速率系数与生物半衰期均与暴露浓度无明显相关性，不同种类的重金属在斑马鱼体内的B1/2按时间长短排序为Ni>Pb>Cu，但排出阶段结束后，斑马鱼体内的重金属浓度依然高于初始浓度数倍甚至数十倍，说明受到重金属污染的斑马鱼，即使在无重金属污染的水中进行饲养，依然难以达到释放重金属的目的。本研究有助于了解Cu、Pb和Ni 3种重金属在斑马鱼体内的生物富集动力学特性，对斑马鱼用于重金属预测，尤其是Cu，提供科学依据与研究支撑。

参考文献

[1]刘宗平.环境铅镉污染对动物健康影响的研究[J].中国农业科学，2005，38（1）：185-186.

[2]张海清，余海珊，崔杰锋，等.龙湾涌沉积物重金属污染现状评价[J].中国环境管理，2001（2）：29-31.

[3]简敏菲，游海，倪才英.鄱阳湖饶河段重金属污染水平与迁移特性[J].湖泊科学，2006，18（2）：127-133.

[4]王胜强，孙津生，丁辉.海河沉积物重金属污染及潜在生态风险评价[J].环境工程，2005，23（2）：62-64.

[5]帅俊松，王琳.浅论重金属污染对人体健康的影响及对策[J].环境与开发，2001，16（4）：62.

[6]李淑琼，周勤.重金属对预警生物斑马鱼的急性毒性研究[J].科技通报，2010，26（3）：454-457.

[7]李汝.基于斑马鱼行为学的水质监测预警技术试验研究[D].济南：山东建筑大学，2015.

[8]张少娜，孙耀，宋云利，等.紫贻贝（Mytilus edulis）对4种重金属的生物富集动力学特性研究[J].海洋与湖沼，2004，35（5）：438-445.

[9]张少娜.经济贝类对重金属的生物富集动力学特性的研究[D].山东青岛：中国海洋大学，2003.

[10]王晓丽，孙耀，张少娜，等.牡蛎对重金属生物富集动力学特性研究[J].生态学报，2004，24（5）：1086-1090.

[11]刘智禹，吴靖娜，李琳，等.浒苔对镉、铅和铝的生物富集动力学研究[J].现代食品科技，2014（10）：154-158.

[12]GB/T 13267—1991.水质 物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法[S].

[13]左甜甜，李耀磊，金红宇，等.ICP-MS法测定18种动物药中重金属及有害元素的残留量及初步风险分析[J].药物分析杂志，2017（2）：61-66.

[14]张振燕，张美琴，吴瑛.重金属Cd与Cu在克氏原螯虾体内富集与释放规律[J].食品科学，2014，35（17）：250-254.

[15]Wang Z，Wang X，Ke C.Bioaccumulation of trace metals by the live macroalga Gracilaria lemaneiformis[J].Journal of Applied Phycology，2014，26（4）：1889-1897.

[16]P.-E L，C.-K L，Din Z.The kinetics of bioaccumulation of zinc，copper，lead and cadmium by oysters （Crassostrea iredalei and C.belcheri）under tropical field conditions[J].Science of the Total Environment，1998，216（1-2）：147-157.

（責任编辑 唐建敏）