不同组分羧甲基茯苓多糖对HepG2细胞增殖的影响

杨焕治 熊芳琪 杨岚 杨中扬 陈咸吉 聂现辉 彭国平

摘 要：目的：探究不同组分羧甲基茯苓多糖（CMP）对HepG2细胞增殖的影响。方法：在不同提取碱浓度和碱处理时间下，采用二次加碱法制备不同组分CMP。利用硫酸-蒽酮法、滴定法和CCK-8法对CMP的含量、取代度和HepG2细胞增殖检测。结果：获得7个组分CMP，含量为85%～90 %，取代度为0.65～0.80。不同浓度CMP培养HepG2细胞24 h下，CMP 750 μg/mL抑制细胞增殖效果最好，其中CMP3抑制率最高达50.035 %。CMP 750 μg/mL培养HepG2细胞24、48、72 h，在48 h下抑制效果最好，其中CMP3抑制效果最高达到76.05 %。在72、48、24 h 下CMP3培养HepG2细胞的IC50分别为26.34、34.06、763.64 μg/mL。结论：CMP能有效抑制HepG2肿瘤细胞的增殖，其中CMP3是7个CMP组分中抑制效果最好的，这与CMP3的含量、浓度呈正相关性，48 h为CMP最适抑制时间。

关键词：不同组分;羧甲基茯苓多糖;HepG2;细胞增殖

茯苓多糖羧甲基化可增加茯苓多糖支链的负电性、水溶性，改善生物功能，提高抗癌活性[1-2]。HepG2是人肝胚细胞瘤细胞系，其保留了较完整的代谢酶，是良好的肝癌发生机制研究材料[3]。CCK-8法是抗肿瘤药物筛选、肿瘤药敏、細胞增殖、细胞毒性试验的理想方法，其操作简便、灵敏度高、可重复性高[4]。目前，大量研究证实，天然提取物能作用于细胞凋亡信号途径中一些重要凋亡因子，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤增殖[5]。迄今全球肝癌的发病率及病死率高居不下，同时肝癌的发生发展机制并未明确[6]。本实验探究不同CMP组分对HepG2细胞增殖影响，为CMP抑制HepG2细胞增殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

白茯苓块，湖南省靖州产;HepG2人肝癌细胞系，采购中科院上海细胞库;无水乙醇（CHO）、氢氧化钠（NaOH）、氯乙酸（ClCH2COOH）、乙醚（C4H10O）、冰醋酸（CH COOH）、丙酮（CH3COCH3）、FeCl3、铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）、三氯乙酸（CH2Cl3O2）都为分析纯，国药集团化学试剂有限公司;RPMI-1640、PBS缓冲液、小牛血清，Hyclone公司;胰蛋白酶消化液、胎牛血清、链霉素、青霉素，GIBCO公司;二甲基亚砜（DMSO）、Tris-Base（SIGMA）、10 %SDS，美国Sigma公司;CCK-8试剂盒，南京凯基生物公司。

FW177型中草药粉碎机、FA/JA系列电子天平、DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵、DZKW-S-4电热恒温水浴锅、PHS-3C pH计、Agilent 8453紫外-可见分光光度计、KQ-3200E超声波清洗器、冷冻高速离心机、细胞恒温箱、光学显微镜、ST-360酶标仪、血球计数板、超净工作台。

1.2 方法

1.2.1 CMP的制备 依据参考文献[7]制备CMP：将茯苓菌块烘干至恒重，然后粉碎过60目筛网。精密称量茯苓粉10 g置于500 mL烧杯中，再加入200 mL蒸馏水，置于超声提取仪中提取30 min，然后浸提过夜，浸提液过滤得滤渣。用5倍不同浓度的NaOH碱溶液（0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L）溶解滤渣。溶解液置于4℃下，浸提不同时间（2、4、6、8 h），抽滤后向碱浸提液中加入氯乙酸和NaOH溶液，70 ℃醚化反应3 h，用乙酸中和至pH为5，醇沉过夜，沉淀抽滤后用无水乙醇、丙酮、无水乙醚进行洗脱，复溶，DEAE-52离子交换柱洗脱，透析，冷冻干燥，得CMP粉。

1.2.2 CMP含量测定 参照文献[8]，利用硫酸-蒽酮法测定CMP含量：准确称取恒重标准葡萄糖20.0 mg，置于三角瓶溶解，容量瓶定容至200.0 mL。分别吸取该溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，并各补蒸馏水至1.0 mL，冰浴5 min后，滴加蒽酮-浓硫酸4.0 mL，沸水浴10 min显色。以0 mL管为参比，用紫外分光光度计在620 nm 波长处测定吸光值。用Excel数据分析获得标准曲线。

1.2.3 CMP取代度测定 滴定法[9]测定CMP的取代度。准确称取0.5 g干燥的CMP于三角瓶中，加入HCl（0.1 mol/L）标准溶液50 mL，NaOH（0.1 mol/L）标准溶液为滴定液，滴定过程中检测滴定溶液pH值。

DS=0.203A/（1-0.058A） A=（V2-V1）M/W（1）

式（1）中，DS：取代度;A：羧甲基的物质的量（mmol）;V1：pH=2时滴定消耗NaOH 体积（mL）;V2 ：pH=4 时消耗NaOH体积（mL）;W：CMP重量（g）;M：NaOH浓度（mol/L）。

1.2.4 HepG2细胞培养 肝癌细胞株HepG2常规培养于含10 %胎牛血清的1640培养基中，置于37 ℃细胞培养箱（5 % CO2）培养，每3 d换液1次。培养至对数生长期。

1.2.5 CCK-8法检测CMP对HepG2细胞增殖抑制作用HepG2细胞（1×104/ mL）接种于96孔板/100 μL，置于37℃细胞培养箱（5 % CO2）培养24 h。弃除原有培养液，分别加入空白对照组（完全培养液），CMP组完全培养液（5、50、100、300、750 μg/mL）每组6个平行孔。96孔板于细胞培养箱中培养2～72 h，弃除旧培养液，再加入100 μL培养液，CCK-8检测液（10 μL）滴加到96孔板，37℃下孵育2.5 h。二甲基亚砜（100 μL）溶解结晶，采用酶标仪在450 nm波长下检测各孔OD值，计算HpeG2细胞生长抑制率。

细胞抑制率（%）= （对照细胞OD值-加药细胞OD值）/对照组OD值×100%（2）

1.3 统计学方法

各组实验数据均重复4次，以平均值±标准差形式表示。采用SPSS 22.0分析组间差异性。P<0.05、P<0.01分别表示组间具有显著性差异、极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 CMP制备的组分、含量及取代度的测定

由图1可知，葡萄糖的标准曲线是y=0.092 43x+0.030 9，R2=0.999线性关系很好。以相同浓度的CMP，进行5次重复实验取数值平均值，测定CMP含量。由表1可知，采用二次加碱法，在不同提取碱浓度和碱处理时间下一共制备了7个不同组分的CMP。通过硫酸-蒽酮法检测CMP的多糖含量在86%～89%之间，取代度在0.665～0.756之间。

2.2 CCK-8法检测CMP对HepG2细胞的抑制作用

2.2.1 CMP样品对 HepG2 细胞的抑制作用 如图2所示，CCK-8法检测7个CMP组分培养HepG2细胞24 h后的抑制率。CMP作用细胞24 h，细胞抑制率与CMP浓度呈正相关。当CMP为750 μg/mL时抑制率最高，其中CMP3对HepG2细胞的抑制率达到50.04 %;当CMP为5 μg/mL时对HepG2细胞的抑制率最低，其中CMP7的抑制率仅为4.25%。

2.2.2 不同培养时间CMP对HepG2细胞的抑制作用

如图3所示，作用48 h和72 h的抑制率差距很小，但明显高于24 h，表明HepG2细胞培养液中加入CMP 48 h后，对细胞的抑制率达到峰值。CMP培养HepG2细胞48 h时，CMP7对HepG2细胞的抑制率极显著低于其他CMP组分，抑制率最低仅为45.32 %，CMP3的抑制率最高为75.26 %。24 h时CMP6对HepG2肿瘤细胞的抑制率均与CMP7具有显著性差异，其他组分CMP为极显著性差异。不同时段下，CMP3对HepG2細胞的抑制率高于其他组分，最高抑制率为76.05 %。

2.2.3 CMP3对HepG2细胞的抑制作用 如图4所示，当CMP3作用HepG2细胞24 h时，随着CMP3浓度增加，细胞抑制率升高呈量—效关系;48 h和72 h时，在CMP3浓度低于100 μg/mL时，抑制率与CMP3浓度呈正相关，高于100 μg/mL时，随着CMP浓度增加，HepG2细胞的抑制率维持在75%左右。通过SPSS 22.0分析CMP3对HepG2细胞在不同时间的IC50（表2）。CMP3作用HepG2细胞72、48、24h的IC50分别为26.34、34.06、763.64 μg/mL，48 h和72 h的IC50与24 h相比，具有极显著性差异时（P<0.01）。48 h与72 h的IC50相比无统计学差异。

3 讨论

本研究采用不同的提取条件，从茯苓中提取了7种不同的CMP组分，并检测不同组分CMP含量、取代度及对HepG2细胞增殖作用影响。探究不同提取条件、不同CMP组分浓度、不同作用时间与抑制HepG2细胞增殖之间的作用关系。研究表明，CMP的含量与取代度与其抑制HepG2的增殖有密切关系，CMP3的含量最高为89.27 %，取代度最低为0.665，对HepG2的生长抑制率最高。NaOH浓度与处理时间有利于茯苓多糖的提取，但是浓度过高和时间过长会导致1，3糖苷键被碱解打断，使得多糖链分子变短，从而导致CMP空间构象的改变，进而影响多糖性质与功效。CMP的取代度主要与NaOH/氯乙酸摩尔比和醚化温度有关及NaOH浓度与碱化时间有关。CMP作用HepG2肝癌细胞48 h对其生长抑制效果最佳;CMP3样品对HepG2细胞的抑制率最高达到76.05 %;CMP3作用于HepG2细胞24、48、72 h的IC50分别为763.64、34.06、26.34 μg/mL。这为后续试验CMP对HepG2细胞凋亡诱导机制的研究提供了基础。

参考文献

[1]杜湛湛.一种粒毛盘菌胞外多糖的结构、硫酸酯化修饰及生物活性研究[D].合肥：合肥工业大学，2015.

[2]申林卉，刘丽侠，陈冠，等.多糖化学结构修饰方法的研究进展[J].药物评价研究，2013，（6）：465-468.

[3]姚晓峰，仲来福.人肝癌细胞系HepG2在遗传毒物检测中的应用及其进展[J].世界华人消化杂志，2007（2）：145-150.

[4]蔡文涛.MTT法和CCK-8法检测中药抗病毒活性成分细胞毒性的比较[J].湖北大学学报（自然科学版），2017，39（3）：305-310.

[5]陈世发，赵礼金.肝癌发生发展机制的研究进展及其治疗现状[J].中国普通外科杂志，2018，27（7）：910-923.

[6]戴焱焱，黄才国，陈若华.天然提取物诱导人HepG2细胞凋亡的研究进展[J].现代生物医学进展，2012，12（20）：3962-3965.

[7]林标声，陈小红，罗茂春.高取代度羧甲基茯苓多糖（CMP）的制备及其注射剂的研制[J].中国农学通报，2015（29）：59-64.

[8]朱伟.蒽酮-硫酸比色法测定香菇多糖含量[J].北方药学，2011（8）：8-9.

[9]樊泽霞，夏俭英.测定羧甲基纤维素钠取代度的新方法—酸度计滴定法[J].钻井液与完井液，1997（5）：37-38.

[10]杨岚，等.三个茯苓材料氨基酸与蛋白质的含量比较[J].中国食物与营养，2019，25（6）：44-46.

Abstract：Objective To study the apoptosis of HepG2 cells in different components of carboxymethytlpachymaram（CMP）.Method CMP of different components was prepared by double alkali addition under different extraction concentration and treatment time.Effects of sulfuric acid - anthrone，titration and CCK-8 on CMP content，degree of substitution and HepG2 cell proliferation were studied.Result Totally 7 components of CMP were obtained，whose polysaccharide content was within the range of 85 %～90 %and degree of substitution was 0.65～0.80.CMP 750 μg/mL had the best inhibitory effect on HepG2 cells at 24 h，and the CMP3 inhibition rate was up to 50.035 %.CMP 750 μg/mL cultured HepG2 cells for 24～72 h had the best inhibitory effect at 48 h，of which CMP3 had the highest inhibitory effect at 76.05 %.The IC50 of CMP3 at 72 h，48h and 24 h was 26.34 μg/mL，34.06 μg/mL and 763.64 μg/mL，respectively.Conclusion CMP can induce the apoptosis of HepG2 cells.Under certain treatment time and concentration，CMP can effectively inhibit the proliferation of HepG2 cells，and its inhibition rate is closely related to the dose-effect and time-effect of concentration，as well as the content and degree of substitution of CMP.

Keywords：different component;carboxymethylpachyman（CMP）;HepG2;cell proliferation（责任编辑 唐建敏）