白藜芦醇/羟丙基-β-环糊精/壳聚糖缓释微球的体外释放度及其在大鼠体内药动学的考察

于琛琛 张纯刚 尹丽 周旖璇 程岚 康廷国

摘 要 目的：考察白藜芦醇/羟丙基-β-环糊精/壳聚糖缓释微球（RES/HP-β-CD/Chitosan）的体外释放度及其在大鼠体内的药动学。方法：采用桨法考察RES原料药、RES/HP-β-CD包合物（RES/HP-β-CD）和RES/HP-β-CD/Chitosan在水中12 h内的体外释放度。比较灌胃给予大鼠RES原料药、RES/HP-β-CD和RES/HP-β-CD/Chitosan后720 min内的药动学特征。结果：与RES原料药比较，RES/HP-β-CD的体外释放度明显增加，120 min的累积释放度为87%;与RES/HP-β-CD比较，RES/HP-β-CD/Chitosan的体外释放明显减缓，释放时间明显延长，12 h的累积释放度为72%。RES原料药、RES/HP-β-CD、RES/HP-β-CD/Chitosan在大鼠体内的药动学参数cmax分别为473.3、2 492.2、590.5 ng/mL，t1/2分别为2.6、0.5、4.6 h，AUC0-12 h分别为514.7、824.6、2 778.5 ng·h/mL。与RES原料药比较，RES/HP-β-CD和RES/HP-β-CD/Chitosan的相对生物利用度分别为172.5%和540.0%。结论：RES/HP-β-CD/Chitosan具有良好的缓释作用，且生物利用度明显高于RES原料药和RES/HP-β-CD。

关键词 白藜芦醇;羟丙基-β-环糊精;壳聚糖;释放度;药动学;大鼠

ABSTRACT   OBJECTIVE： To investigate in vitro release rate and in vivo pharmacokinetics of Resveratrol/hydroxypropyl-β- cyclodextrin/chitosan sustained-release pellets （RES/HP-β-CD/Chitosan） in rats. METHODS： In vitro release rate of RES raw materials， RES-HP-β-CD complexes （RES/HP-β-CD） and RES/HP-β-CD/Chitosan in water within 12 h were investigated by paddle method. The pharmacokinetic characteristics of RES raw materials， RES/HP-β-CD and RES/HP-β-CD/Chitosan were compared within 720 min after intragastric administration. RESULTS： Compared with RES raw materials， in vitro release rate of RES/HP-β-CD was increased significantly， and 120 min accumulative release rate reached 87%. Compared with RES/HP-β-CD， in vitro release rate of RES/HP-β-CD/Chitosan were relieved significantly; release time prolonged significantly; 12 h accumulative release rate was 72%. The pharmacokinetic parameters of RES raw materials， RES/HP-β-CD and RES/HP-β-CD/Chitosan included that cmax were 473.3， 2 492.2， 590.5 ng/mL; t1/2 were 2.6， 0.5， 4.6 h; AUC0-12 h were 514.7， 824.6， 2 778.5 ng·h/mL. Compared with RES raw materials， relative bioavailability of RES/HP-β-CD and RES/HP-β-CD/Chitosan were 172.5% and 540.0%. CONCLUSIONS： RES/HP-β-CD/Chitosan shows good sustained-release effect， and its bioavailability is significantly higher than that of RES raw materials， RES/HP-β-CD.

KEYWORDS   Resveratrol; Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; Chitosan; Release rate; Pharmacokinetics; Rats

白藜蘆醇（Resveratrol，RES），化学名为3，5，4’-三羟基芪，是非黄酮类多酚化合物[1-2]，其主要存在于花生、葡萄、虎杖等植物中[3-8]。研究表明，RES具有广泛的药理作用，主要包括免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、保护心血管等作用[9-14]。RES属于生物药剂学分类系统（BCS）Ⅱ药物，其易溶于乙醇、甲醇、二甲基亚砜等有机溶剂，然而在水中的溶解度极低，仅为30 μg/mL [15-16]，且具有光不稳定性。由于RES的水溶性差、性质不稳定、生物利用度低，限制了其在临床上的应用。

羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）是β-CD葡萄糖残基上的羟基发生醚化反应引入羟丙基所产生的产物，其水溶性较大[17]。壳聚糖（Chitosan）是一种生物黏附材料，通过黏附作用及亲水凝胶特性，可以延长药物在体内的滞留时间和释放时间，增加药物的吸收。药物与HP-β-CD制备成包合物后，能够显著提高药物的溶解度和溶出度。本课题组采用溶剂法制备出了RES/HP-β-CD包合物（RES/HP-β-CD），并在此基础上加入Chitosan制备成RES/HP-β-CD/Chitosan缓释微球（RES/HP-β-CD/Chitosan）。以期通过HP-β-CD解决RES的释放问题，同时结合壳聚糖的生物黏附特性和缓慢释放特性，实现延长RES在体内的释放时间，提高其生物利用度。本文主要就RES/HP-β-CD/Chitosan的体外释放度及其在大鼠体内的药动学进行考察。由于RES具有光不稳定性，故本研究中所有操作过程全部避光。

1 材料

1.1 仪器

FA1004 精密电子天平（天津天马衡基仪器有限公司）;LC-2010A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）;Vortex-5 涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;TGL-16g 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）;UV1600紫外分光光度计（上海美普达仪器有限公司）;Bioq-8000喷雾干燥仪[汇和堂生物工程设备（上海）有限公司]。

1.2 药品与试剂

RES原料药（武汉远成共创科技有限公司，批号：20171225，纯度：98%）;RES对照品（南京森贝伽生物科技有限公司，批号：111535-201502，纯度：98%）;卡马西平对照品（内标，上海哈灵生物科技有限公司，批号：100142-201605，纯度：98%）;RES/HP-β-CD/Chitosan（辽宁中医药大学药学院自制，批号：20180321，RES含量：12%）;HP-β-CD（山东滨州智源生物科技有限公司，批号：20171201）;Chitosan（潍坊海之源生物制品有限公司，批号：160815A）;乙腈（瑞典欧森巴克化学公司，色谱级）;醋酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.3 动物

健康SD大鼠18只，♂，体质量（250±20） g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK（辽）2015-0001。

2 方法与结果

2.1 制剂中RES的含量测定

2.1.1 紫外吸收波长的选择 取干燥至恒质量的RES对照品适量，置于量瓶中，加1%醋酸10 mL，超声（功率：180 W，频率：59 kHz，时间：2 min，下同）溶解，并用无水乙醇稀释成质量浓度为5 μg/mL的溶液，同法配制相应浓度的辅料溶液，采用紫外分光光度法，在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描。结果显示，RES在307 nm波长处有最大吸收，辅料对其测定无干扰，故选择307 nm波长作为RES的含量测定波长，紫外光谱图见图1。

2.1.2 标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒质量的RES对照品30 mg，置于100 mL量瓶中，加1%醋酸10 mL，超声溶解，并用无水乙醇定容至刻度，制成RES贮备液。分别精密移取RES贮备液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，置于100 mL量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为1.8、2.4、3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0 µg/mL的标准系列溶液。采用紫外分光光度法，在307 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标（y），质量浓度为横坐标（x）进行回归分析，得回归方程为y=0.130 1x-0.009 2（R2=0.999 7），结果表明，RES质量浓度在1.8～6.0 µg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.1.3 精密度试验 取RES/HP-β-CD/Chitosan，研细，精密称取适量，置于100 mL量瓶中，加1%醋酸10 mL，超声，使RES溶解，放冷，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液1 mL，置于100 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，制成RES质量浓度分别为2.8、4.2、5.4 μg/mL（低、中、高质量浓度）的供试品溶液。在307 nm波长处测定供试品溶液中RES吸光度，每个浓度重复测定3次，计算日内精密度;连续测定3 d，计算日间精密度。结果显示，低、中、高质量浓度供试品溶液的日内RSD分别为0.30%、0.32%、0.25%（n=3）;日间RSD分别为0.48%、0.21%、0.27%（n=3），均符合方法学要求。

2.1.4 回收率试验 分别称取24、30、36 mg的RES对照品以及RES/HP-β-CD/Chitosan相应处方量的辅料于100 mL量瓶中，加1%醋酸10 mL，超声，使RES溶解，放冷，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置于100 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，每个浓度制备3份，在307 nm波长处测定RES吸光度，计算含量。以RES的测得值与加入值进行比较，计算回收率。结果显示，平均回收率分别为100.00%、100.24%、99.70%（n=3），符合方法学要求。

2.1.5 稳定性试验 取供试品溶液，在室温下放置0、1、2、4、8、12 h后，在307 nm波长处测定RES吸光度。结果显示，吸光度的RSD<1%（n=6），表明供試品溶液在室温条件下放置12 h的稳定性良好。

2.2 体外释放度的测定

参照2015年版《中国药典》（四部）第二法（桨法）测定体外释放度[18]。将相当于RES 300 mg的RES原料药、RES/HP-β-CD、RES/HP-β-CD/Chitosan分别置于（37±0.5） ℃、体积为900 mL的水中，转速为100 r/min，分别在预定的时间点（RES原料药和RES/HP-β-CD为0、5、10、15、30、60、90、120 min，RES/HP-β-CD/Chitosan为0、1、2、3、4、6、8、12 h）取样5 mL（同时补充5 mL 水），经0.45 μm微孔滤膜滤过，用水适当稀释后，在307 nm波长处测定RES吸光度，计算累积释放度（Q），绘制体外释放曲线。RES原料药、RES/HP-β-CD和RES/HP-β-CD- Chitosan的体外释放曲线见图2。

由图2显示，与RES原料药比较，RES/HP-β-CD的体外释放度明显增加，5 min时释放度达到最大，且在120 min内保持稳定，120 min的累积释放度为87%;与RES/HP-β-CD比较，RES/HP-β-CD/Chitosan的体外释放明显减缓，释放时间明显延长，12 h的累积释放度为72%。

2.3 生物样品中RES的含量测定

2.3.1 RES系列对照品溶液的制备 精密称取RES对照品适量，用甲醇溶解定容，制备成质量浓度为1.0    mg/mL的RES贮备液。精密量取RES贮备液适量，用甲醇制成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、25 μg/mL的系列对照品溶液，于4 ℃冰箱保存，备用。

2.3.2 RES系列质控标准溶液的制备 精密量取RES贮备液适量，用甲醇将其稀释成低、中、高质量浓度（0.2、1.0、20 μg/mL，下同）的RES质控标准溶液，于4 ℃冰箱保存，备用。

2.3.3 内标溶液的制备 精密称取卡马西平对照品适量，用甲醇溶解定容，制成质量浓度为1.0 mg/mL的内标贮备液。精密量取内标贮备液适量，用甲醇稀释成质量浓度为25 μg/mL的内标溶液。

2.3.4 色谱条件 色谱柱：Agilent Extend C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）;预柱：Phenomenex C18（4.0 mm×2.0 mm，5 μm）;流动相：乙腈-水（30 ∶ 70，V/V）;流速：1.0 mL/min;进样量：30 μL;检测波长：307 nm;柱温：30 ℃。

2.3.5 血浆样品的处理 取100 μL血浆，置于1.5 mL EP管中，依次加入甲醇10 μL、内标溶液10 μL、0.5%醋酸50 μL，涡旋1 min，再加入乙腈200 μL沉淀蛋白，     12 000 r/min离心10 min，取上清液30 μL进样分析。

2.3.6 专属性考察 取大鼠空白血浆100 μL，按“2.3.5”项下方法操作，将其中加入10 μL内标溶液改为加入10 μL甲醇，然后进样测定;将加入RES对照品溶液的空白血浆，按“2.3.5”项下方法处理后进样测定;取“2.4”项下给药后5 min大鼠血浆样品，按“2.3.5”项下方法处理后进样测定。结果显示，在该色谱条件下，RES与内标的保留时间分别为4.911、10.291 min，两者分离度良好，且血浆内源性物质不干扰RES的测定，色谱图见图3。

2.3.7 标准曲线与定量下限考察 取大鼠空白血浆8份，按“2.3.5”项下方法操作，将其中加入10 μL甲醇改为加入10 μL RES系列对照品溶液，制成质量浓度分别为10、20、50、100、200、500、1 000、2 500 ng/mL的标准血浆样品，进样测定。以RES质量浓度为横坐标（x），RES与内标的峰面积比值为纵坐标（y），采用加权最小二乘法进行回归，得回归方程为y=0.004 6x+0.092（r=0.999 2），RES质量浓度在10～2 500 ng/mL范围内与峰面积的线性关系良好，定量下限为10 ng/mL。

2.3.8 精密度和准确度试验 取低、中、高质量浓度的质控标准溶液，按“2.3.5”项下方法处理后进样测定，记录峰面积，每个浓度测定6次，连续测定3 d，考察日内、日间精密度与准确度。结果显示，日内精密度分别为2.88%、2.15%、1.68%（n=6）;日间RSD分别为2.72%、2.04%、1.98%（n=3），准确度分别为（100.00±2.88）%、（100.80±2.17）%、（98.60±1.65）%（n=6），均符合要求。

2.3.9 提取回收率 取低、中、高质量浓度的质控标准溶液，按“2.3.5”项下方法处理后进样测定，每个浓度测定6次，记录峰面积为A1;另取大鼠空白血浆100 μL，加入甲醇10 μL，乙腈200 μL，渦旋5 min，经12 000 r/min离心10 min，取上清液，再加入相应质量浓度的RES对照品溶液和内标溶液，进样分析，每个浓度测定3次，记录峰面积为A2。以A1与A2的比值计算提取回收率。结果显示，低、中、高质量浓度的提取回收率分别为（98.2±1.0）%、（99.4±0.7）%、（101.2±2.7）%（n=3）。按照上述方法测得内标的提取回收率为98.6%（n=3）。

2.3.10 稳定性试验 取大鼠空白血浆100 μL，按“2.3.5”项下方法操作，将其中加入10 μL甲醇改为加入10 μL低、中、高质量浓度RES对照品溶液，制成RES血浆样品，每个浓度进行3样本分析，分别考察室温放置2 h、处理后4 ℃放置24 h、冻融循环1次、冻融循环3次、  -20 ℃放置30 d的稳定性。结果显示，RES血浆样品在上述条件下的RE均在±15%内，结果见表1。

2.4 药动学实验

将18只SD大鼠随机分为RES原料药组、RES/HP- β-CD组、RES/HP-β-CD/Chitosan组，每组6只，分别灌胃给予RES原料药、RES/HP-β-CD和RES/HP-β-CD/Chitosan，给药量以RES计为20 mg/kg[17]，灌服前，样品均混悬于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中。实验前大鼠禁食12 h，自由饮水，分别于给药后5、10、15、30、45、60、120、240、360、480、720 min眼眶取血0.5 mL，置于肝素化EP管中，4 000 r/min离心10 min，取上清液，于-20 ℃下冷冻保存。按“2.3”项下方法测定不同时间血浆样品中RES的浓度，绘制药-时曲线，采用DAS 3.0软件计算药动学参数。RES原料药、RES/HP-β-CD和RES/HP-β-CD/  Chitosan在大鼠体内的药-时曲线见图4，药动学参数见表2。

由表2显示，与RES原料药组，RES/HP-β-CD 组的cmax明显升高;与RES/HP-β-CD组比较，RES/HP-β-CD/Chitosan组的tmax明显延长，cmax明显降低，AUC0-12 h明显增加。与RES原料药相比，RES/HP-β-CD和RES/HP- β-CD/Chitosan的相对生物利用度分别为172.5%和540.0%。

3 討论

本课题组先通过制备RES/HP-β-CD 提高RES的体外释放度;再利用Chitosan是自然界广泛存在的多糖，具有良好的生物相容性、生物黏附性的特性，且对细胞无毒[19]，对RES/HP-β-CD 进行改良，制得RES/HP-β-CD/Chitosan。本文体外释放度试验和大鼠体内药动学研究均表明，与RES原料药比较，RES/HP-β-CD的体外释放度明显增加，体内药物浓度也明显增加;与RES/HP-β- CD 比较，RES/HP-β-CD/Chitosan的释放明显减缓;且RES/HP-β-CD/Chitosan的AUC0-12 h是RES原料药的5.5倍。该缓释载药系统提高药物生物利用度的主要原因如下：（1）由于Chitosan在稀酸条件下，氨基质子化，形成NH3+。质子化后，正电荷互相排斥使得Chitosan分子链呈舒展状态，黏度增大，在微球表面形成凝胶，延缓药物释放;（2）由于细胞膜表面为负电荷，通过正、负电荷吸引Chitosan与黏膜产生黏附作用，延长药物在胃肠道的滞留时间，从而增加药物生物利用度[20];（3）Chitosan可以改变 F肌动蛋白（F-actin）的分布从而影响细胞间紧密连接的，通过打开连接增加黏膜的通透性，使药物更好地吸收[21]。

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（收稿日期：2019-06-14 修回日期：2019-07-15）

（編辑：邹丽娟）