昆明山海棠-鸡血藤药对治疗类风湿关节炎作用机制的网络药理学研究

刘丹凯 王强 魏赈权 刘小宝 郑雪霞 钱凯 曾丽盈 许舒迪 林昌松

摘 要 目的：研究昆明山海棠-雞血藤药对治疗类风湿关节炎的作用机制。方法：通过检索治疗靶点数据库（TTD）、药物银行（DrugBank）和DisGeNET数据库获取类风湿关节炎靶点，并构建靶点互作（PPI）网络筛选关键靶点。以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18、半衰期（HL）≥4 h为指标，借助中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP）和中药综合数据库（TCMID）获取昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分，并预测其靶点，构建昆明山海棠-鸡血藤药对活性成分-靶点网络;借助Systems Dock Web Site在线平台、Genomics平台筛选昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分和类风湿关节炎的共有靶点，然后利用Cytoscape 3.2.1软件中Cluego插件分析共有靶点的京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路。结果：共检索到类风湿关节炎靶点1 956个，其中关键靶点11个[包括白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）等];昆明山海棠-鸡血藤药对共筛选出30种活性成分（包括木犀草素、芒柄花黄素、β-谷甾醇、雷公藤甲素等）和229个靶点。昆明山海棠-鸡血藤药对和类风湿关节炎的共有靶点有37个[包括基质金属蛋白2（MMP2）、 TNF、VEGFA等];参与的KEGG信号通路有细胞凋亡、IL-17信号通路、Th17细胞分化信号通路、TNF信号通路等。结论：昆明山海棠-鸡血藤药对可能通过MMP2、TNF、VEGFA等靶点作用于细胞凋亡、IL-17信号通路等多条信号通路发挥治疗类风湿关节炎的作用，本研究结果可为进一步研究昆明山海棠-鸡血藤药对治疗类风湿关节炎的作用机制提供参考。

关键词 类风湿关节炎;昆明山海棠-鸡血藤药对;网络药理学;作用机制;信号通路

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of couplet medicine of Tripterygium hypoglaucum-Spatholobus suberectus in the treatment of rheumatoid arthritis （RA）. METHODS： The RA targets were retrieved and obtained by therapeutic target database （TTD）， DrugBank and DisGeNET databases， and the protein protein interaction （PPI） network was constructed to screen its key targets. Using oral bioavailability（OB）≥30%， drug like（DL）≥0.18 and drug half-life （HL） ≥4 h as index， active components were obtained from couplet medicine of T. hypoglaucum-S. suberectus by using TCM systematic pharmacological analysis platform （TCMSP） and TCM integrated database （TCMID）， and the targets were predicted. The active component-target network of couplet medicine of T. hypoglaucum-S. suberectus was constructed. Systems Dock Web Site online platform and Genomics platform were used to screen the active component and common targets of RA of couplet medicine of T. hypoglaucum-S. suberectus; KEGG signaling pathways of common targets were analyzed by using Cluego plug-in unit of Cytoscape 3.2.1 software. RESULTS： Totally 1 956 RA targets were retrieved， involving 11 key targets [such as IL-6， TNF， VEGFA]. The couplet medicine contained 30 active components （including luteolin， erythroxanthin， β-sitosterol and triptolide） and 229 targets. There were 37 common targets for couplet medicine of T. hypoglaucum-S. suberectus and RA （including MMP2， TNF， VEGFA）. KEGG signaling way involved cell apoptosis， IL-17 signaling pathway， Th17 cell differentiation pathway and TNF signaling pathway. CONCLUSIONS： The couplet medicine of T. hypoglaucum-S. suberectus may play a role in the treatment of RA by acting on cell apoptosis， IL-17 signaling pathway and other signaling pathways through MMP2， TNF， and VEGFA target. The results of this study can provide a reference for further study on the mechanism of the effects of couplet medicine of T. hypoglaucum-S. suberectus on RA.

KEYWORDS Rheumatoid arthritis; Couplet medicine of Tripterygium hypoglaucum-Spatholobus suberectus; Network pharmacology; Mechanism; Signaling pathways

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病，基本病理改变是滑膜炎和血管炎，滑膜炎是关节表现的基础，血管炎是关节外表现的基础，可逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，其发病机制目前尚不明确;目前RA不能根治，其常用治疗药物可分为非甾体抗炎药、抗风湿药、糖皮质激素、植物药和生物制剂等五大类[1]。其中，以中药为主的植物药不仅来源广泛、种类丰富，而且具有多靶点、多途径、多环节以及整体调节的特点，在治疗RA方面有独特的优势[2-3]。

昆明山海棠为卫矛科雷公藤属植物，具有祛风除湿、舒筋活络、清热解毒的作用[4]。现代药理研究表明，昆明山海棠具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗病毒等作用[5]。鸡血藤为豆科植物密花豆的干燥藤茎，具有活血补血、调经止痛、舒筋活络之功效[4]。现代药理研究表明，鸡血藤具有免疫调节、抗炎、抗氧化、促进造血、抗肿瘤、抗病毒等作用[6]。

我院风湿病科常用院内制剂昆藤通痹合剂（批准文号：粤药制字Z20071157，旧名为二藤通痹合剂，主要成分为昆明山海棠和鸡血藤）治疗RA，临床疗效明显。本课题组前期在观察162例RA患者服用二藤通痹合剂后，发现其能有效改善患者的的晨僵时间、休息痛和压痛关节数等临床症状[7]。其联合正清风痛宁缓释片能有效改善活动期RA患者关节疼痛肿胀的症状，增强抗炎镇痛的作用[8]。由于中药及其复方具有“多成分、多途径、多靶点”的特点，疗效通常取决于其中有效成分群的综合作用。网络药理学是基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，系统综合评价药物对疾病网络的干预，这与中药及其方剂的多成分、多途径、多靶点协同作用的原理相一致[9]，故利用网络药理学有助于进一步探讨昆明山海棠-鸡血藤药对治疗RA的作用机制。

因此，本研究拟通过网络药理学对昆明山海棠-鸡血藤药对治疗RA的活性成分、作用靶点、作用通路等进行研究，为其临床应用及深入研究提供依据。

1 方法

1.1 RA靶点获取及靶点蛋白互作（PPI）网络构建

1.1.1 RA靶点获取 以“Rheumatoid arthritis”为关键词，通过检索治疗靶点数据库（TTD）数据库（网址为https：//db.idrblab.org/ttd/）、药物银行（DrugBank）数据库（网址为https：//www.drugbank.ca/）、DisGeNET数据库（网址为http：//www.disgenet.org/）查询RA相关靶点。由于靶点命名存在不规范及信息来源不同等现象，本研究使用Uniprot數据库（网址为https：//www.uniprot.org/）对靶点进行校正，并筛除重复项。

1.1.2 RA靶点PPI网络构建 将RA靶点导入STRING 平台（网址为https：//string-db.org/）构建PPI网络，将物种设置为“Homo sapiens”，其他参数保持默认设置，并使用Cytoscape 3.2.1软件（网址为http：//cytoscapeweb.cytoscape.org/）对PPI网络进行分析，利用Network Analyzer分析节点度值和介度中心性。其中，度值反映与节点直接相连的节点数目，度值高的节点可能在网络中起到桥梁的作用;介度中心性是网络中经过某一节点的最短路径数，介度中心性越大，该节点影响力越大[10]。本研究选取度值、介度中心性同时满足排名前15的节点作为其关键靶点。

1.2 昆明山海棠-鸡血藤药对活性成分-靶点网络的构建

1.2.1 昆明山海棠-鸡血藤药对活性成分和靶点获取 以“昆明山海棠”为关键词，通过检索中药综合数据库（TCMID，网址为http：//183.129.215.33/tcmid/）获取昆明山海棠的活性成分（由于TCMID数据库检索到的成分较少，故本研究将所有成分都纳入分析）;以“鸡血藤”为关键词，通过检索中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP）数据库（网址为http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php） 获取鸡血藤的活性成分。根据药动学特性（ADME）参数，利用口服生物利用度（OB）与类药性（DL）及半衰期（HL）进行筛选，筛选标准是OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h[11]。将获得的活性成分通过DrugBank数据库提取靶点，并在Uniprot数据库进行靶点校正。为方便作图，本研究将筛选出的成分以中药名单词首字母和两个数字进行组合编码。

1.2.2 昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分-靶点网络 将昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分和靶点导入Cytoscape 3.2.1软件构建昆明山海棠-鸡血藤活性成分-靶点网络，分析节点的度值和介度中心性，用于评价昆明山海棠-鸡血藤药对中活性成分的重要程度，本研究选取两者同时满足排名前10的节点作为昆明山海棠-鸡血藤药对的重要成分。

1.3 昆明山海棠-鸡血藤药对的重要成分-RA关键靶点的分子对接

将昆明山海棠-鸡血藤药对中的重要成分和RA关键靶点通过Systems Dock WebSite在线平台（网址为http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）进行分子对接评估其结合活性，使用Docking Score评价中药与靶点之间的结合活性，当Docking Score值>4.25表示分子与靶标具有一定的结合能力，>5.00表示结合能力较强，>7.00表示结合能力很强[12]。

1.4 昆明山海棠-鸡血藤药对与RA共有靶点筛选

将昆明山海棠-鸡血藤药对与RA靶点导入Genomics平台（网址为http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）进行映射构建韦恩图，取三者交集得到昆明山海棠-鸡血藤药对和RA的共有靶点。

1.5 共有靶点通路富集分析及昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分-靶点-KEGG通路网络构建

将共有靶点导入Cytoscape 3.2.1软件中的Clugo插件进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集（P<0.05），结合相关文献筛选与RA相关的通路，并将与RA相关的通路、活性成分和靶点导入Cytoscape 3.2.1软件构建昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分-靶点- KEGG通路网络进行可视化处理，从而更直观地反映昆明山海棠-鸡血藤的活性成分、靶点与通路之间的关系。

2 结果

2.1 RA靶点获取与PPI网络构建结果

本研究共筛选到1 956个RA靶点。通过STRING 平台构建PPI网络，并使用Cytoscape 3.2.1软件进行分析。PPI网络包含1 807个节点，61 986条边，平均度值68.61，平均介度中心性0.52（本网络介度中心性数值较小，结果是取lg对数后的值，下同）。选取度值、介度中心性同时满足排名前15的节点作为其关键靶点，包括白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、苏氨酸激酶1（AKT1）、胰岛素（INS）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、血清白蛋白（ALB）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶3 （MAPK3）。RA的关键靶点见表1。

2.2 昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分-靶点网络的构建结果

2.2.1 昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分和靶点的获取 通过TCMSP和TCMID数据库，昆明山海棠共纳入10个成分;鸡血藤共纳入20个活性成分。将成分通过DrugBank数据库预测靶点，并通过Uniprot数据库校正并删除重复项后，昆明山海棠纳入93个靶点，鸡血藤纳入136个靶点。昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分见表2。

2.2.2 昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分-靶点网络的构建 将昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分和靶点导入Cytoscape 3.2.1软件构建昆明山海棠-鸡血藤药对活性成分-靶点网络，详见图1。结果，昆明山海棠-鸡血藤药对活性成分-靶点网络中共202个节点，503条边，平均度值为4.91，平均介度中心性为0.01。其中，节点代表成分和靶点，边代表节点之间的作用关系;度值越大，相应节点越大。选取度值、介度中心性同时满足排名前10的节点作为昆明山海棠-鸡血藤药对的重要活性成分，其重要活性成分有木犀草素、芒柄花黃素、β-谷甾醇、雷公藤甲素，详见表3。

2.3 昆明山海棠-鸡血藤药对的重要活性成分-RA关键靶点的分子对接结果

将昆明山海棠-鸡血藤药对的重要活性成分-RA关键靶点通过Systems Dock WebSite在线平台进行分子对接，结果：昆明山海棠-鸡血藤药对中的雷公藤甲素、木犀草素和β-谷甾醇与RA关键靶点具有较强的结合能力。昆明山海棠-鸡血藤药对的重要活性成分-关键靶点的分子对接结果见表4。

2.4 昆明山海棠-鸡血藤药对与RA共有靶点的筛选结果

昆明山海棠-鸡血藤药对与RA共有靶点的韦恩图见图2、共有靶点见表5。

2.5 共有靶点通路富集分析及昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分-靶点-KEGG通路网络的构建结果

2.5.1 共有靶点通路富集结果 将37个共有靶点通过Cytoscape 3.2.1软件中的Clugo插件进行KEGG通路富集，结果显示，与RA相关的信号通路有细胞凋亡（Apoptosis）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、Th17细胞分化（Th17 cell differentiation）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、类风湿关节炎相关通路（Rheumatoid arthritis related pathway）、核转录因子κB（NF-κB）信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）、Th1和Th2细胞分化（Th1 and Th2 cell differentiation）、TGF-β信号通路（TGF-beta signaling pathway）。昆明山海棠-鸡血藤药对治疗RA的KEGG信号通路见图3。

2.5.2 昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分-靶点-KEGG通路网络图的构建结果 为了直观地反映昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分、靶点与KEGG通路之间的关系，本研究将相关数据导入Cytoscape 3.2.1软件构建昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分-靶点-KEGG通路网络，详见图4。

由图4可知，昆明山海棠-鸡血藤药对中分别有23、7、12和23种活性成分作用于IL-17信号通路、细胞凋亡通路、Th17细胞分化通路和TNF信号通路（即P值最小和靶点数量最多的前4条通路）。其中作用于IL-17信号通路和TNF信号通路的活性成分最多且成分一致。表明，昆明山海棠-鸡血藤药对的活性成分很可能通过作用于多条信号通路尤其是IL-17信号通路和TNF信号通路发挥治疗RA的作用。

3 讨论

根据分子对接结果可知，昆明山海棠-鸡血藤药对发挥作用的主要成分可能为雷公藤甲素、木犀草素和β-谷甾醇。相关研究发现，雷公藤甲素对RA患者体外培养的成纤维滑膜细胞具有一定的增殖抑制并能诱导其凋亡的作用[13];木犀草素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和免疫双向调节等作用[14];β-谷甾醇是植物甾醇的重要组成成分，具有抗炎、调节人体甾体激素、抗氧化、抗肿瘤等作用[15]。因此，雷公藤甲素、木犀草素和β-谷甾醇很可能是该药对治疗RA的有效成分。

根据RA关键靶点和共有靶点分析，昆明山海棠-鸡血藤药对作用的关键靶点可能为TNF、TP53、VEGFA、STAT3。相关研究表明，TNF-α通过抑制骨胶原合成、刺激成纤维细胞和软骨细胞产生前列腺素和胶原酶、刺激软骨细胞分泌金属蛋白酶、诱导外周血单核细胞分化为破骨细胞等途径，促进软骨破坏，加重炎性反应[16]。另有研究发现，RA滑膜衬里层VEGF蛋白表达与血管形态、弯曲血管走行方式及血管密度均呈正相关[17]。STAT3可诱导基质细胞RANKL表达的能力，加剧RA骨侵蚀，而沉默STAT3能明显抑制成纤维样滑膜细胞的增殖[18-19]。TP53在肿瘤的发生、增殖与转移有一定的作用[20]。故昆明山海棠-鸡血藤药对很可能通过调节TNF、VEGFA和STAT3靶点治疗RA。

KEGG通路富集分析结果显示，昆明山海棠-鸡血藤药对可能通过作用于细胞凋亡、IL-17信号通路、Th17细胞分化和TNF信号通路等通路发挥治疗作用。相关研究表明，IL-17信号通路可通过诱导滑膜细胞、软骨和骨细胞分泌的促炎症细胞因子，促进成纤维细胞、内皮细胞等分泌IL-6、IL-8[21-22]。Th17细胞介导炎症反应并在自身免疫性疾病中发挥重要的作用，IL-17为Th17细胞的主要效应因子[23]。RA患者外周血CD4+T淋巴细胞凋亡减少，CD4+T淋巴细胞作为效应T淋巴细胞的重要成分，可参与免疫应答过程中的各个阶段，是RA浸润的炎细胞[24]。因此，细胞凋亡、IL-17信号通路、Th17细胞分化和TNF信号通路等通路很可能是昆明山海棠-鸡血藤药对治疗RA的潜在信号通路。

综上所述，本研究采用网络药理学对昆明山海棠-鸡血藤药对活性成分、作用靶点、作用通路进一步探讨，发现昆明山海棠和鸡血藤药对中的雷公藤甲素、木犀草素和β-谷甾醇等成分很可能通过TNF、VEGFA和STAT3等靶点作用于细胞凋亡、IL-17信号通路、Th17细胞分化和TNF信号通路等多条信号通路发挥作用。因此，昆明山海棠-鸡血藤药对治疗RA的药理学机制很可能是通过多组分、多靶点、多通路实现的。但由于数据库中纳入的信息可能来源于不同的试验条件，偏向于对热点领域的研究等局限性，且中药在煎煮过程中可能生成或破坏某些成分，故纳入分析的成分不一定能反映其实际作用于人体的成分。因此，本研究可为下一步研究提供参考，但昆明山海棠-鸡血藤药对治疗RA复杂的机制还有待进一步试验验证。

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（收稿日期：2019-04-20 修回日期：2019-07-10）

（编辑：唐晓莲）