不同冻结方式对中华绒螯蟹蟹肉品质的影响

邵俊杰　朱昱璇　黄鸿兵　张世勇　潘建林　万金娟　陈风蔚　尹思慧　张美琴　付龙龙　马昊

摘要：为探究冻结方式对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）蟹肉生化特性和感官品质的影响，以鲜活中华绒螯蟹为原料，分别进行-20℃、-40℃、-70℃、液氮速冻处理，之后于20℃条件下储藏180d，分析中华绒鳌蟹感官特性、pH值、失水率、丙二醛含量盐溶性蛋白质含量、总巯基含量和Ca2+-ATPase活性等指标的变化趋势。结果表明，随着冻藏时间的延长，中华绒螯蟹蟹肉的pH值降低，失水率增大，盐溶性蛋白质含量降低，丙二醛含量增大，总巯基含量降低，Ca2+-ATPase活性下降。中华绒螯蟹肌原纤维蛋白的变性程度与冻结方式密切相关。冻结温度越低，冻藏期内蟹肉各指标数值变化越小，蛋白质完整度和感官接受度越高，与新鲜蟹肉品质越接近。与-20℃、-40℃、-70℃速冻处理相比，液氮速冻能更好地减缓蟹肉蛋白质变性和脂肪氧化，能最大限度地保持蟹肉感官品质，是最佳的速冻工艺。

关键词：中华绒螯蟹;冻结方式;感官品质;生化特性

中图分类号：TS254.4

文献标识码：A

文章编号：1000-4440（2019）02-0429-07

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），又称河蟹、大闸蟹、螃蟹，是中国特有的、经济价值较高的名贵水产品。中华绒螯蟹因其肉质细嫩，蛋白质含量高，不饱和脂肪酸种类丰富，富含钙、磷、铁、锌、铜、糖类、蟹黄素、蟹红素等营养物质[1-2]，深受消费者欢迎。近年来，中国中华绒螯蟹养殖业发展迅速，现已成为特种水产品中最具影响力的产业之一。中华绒螯蟹是季节性非常强的水产品，上市时间集中，只有在每年固定的时间节点，中华绒螯蟹才能膏满黄肥。因此，为防止市场上因中华绒螯蟹积压而出现腐败变质问题，同时保证中华绒螯蟹能够全年供应，满足出口需求，中华绒螯蟹的冻藏加工技术研究已迫在眉睫。

冻藏是现在最普遍和最有效的农产品保藏方法，对水产品贮藏、运输和加工意义重大[34]。冷冻处理能够抑制微生物生长和内源酶作用，延长产品货架期，但也会造成蛋白质变性和脂肪氧化，改变肌肉的结构特性、保水性、风味等品质特性，对产品销售和食用产生负面影响[57]。有研究者发现，肌肉品质变化与冻结方式有紧密联系[4，8]。因此，研究冻结方式对中华绒螯蟹蟹肉生化特性的影响、筛选最佳冻藏工艺对蟹肉品质提升十分必要。

目前，低温冻结技术针对的水产品主要是海水鱼[9-10]、虾等，关于中华绒螯蟹冻藏工艺的报道较少。因此，本研究通过测定冻藏期内中华绒螯蟹肌肉感官特性、pH值、失水率、丙二醛（Malondialde-hyde，MDA）含量、盐溶性蛋白质含量、总巯基含量、Ca2+-ATPase活性等指标，分析不同冻结方式对中华绒螯蟹蟹肉品质的影响，为中华绒螯蟹原料加工利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活雄性中华绒螯蟹由宿迁市成子湖食品有限公司提供，体质量为（140+15）g，江苏省淡水水产

研究所鉴定为中华绒螯蟹。

MDA测定试剂盒、Ca2+-ATP酶活性试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DW-225低温试验箱，南京泰斯特试验设备有限公司产品;C-MAG HS7数显加热磁力搅拌器、U1-tra Turrax T-25 Basic高速匀浆机，德国IKA公司产品;211 pH计，意大利Hanna公司产品;Kjeltec'M2300全自动凯氏定氮仪，瑞典FOSS公司产品;M2e酶标仪，美国MD公司产品;Beckman Avanti J-A和AR64离心机，美国Beckman Coulter公司產品;ZKSY-600水浴锅，南京科尔仪器设备有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 中华绒螯蟹冻结和贮藏

将鲜活中华绒螯蟹用水冲洗干净并沥干，然后进行如下冻结处理。①快速冻结：将中华绒螯蟹分别放入-20℃、-40℃、-70℃的低温试验箱中速冻，直至中华绒螯蟹腹部中心温度达到-20℃，所用时间依次为185min、136 min和45 min;②液氮速冻：将中华绒螯蟹浸没于液氮中直至中心温度达到-209C，所用时间为90s。将冻结完成的中华绒螯蟹置于保鲜盒中密封，在-20℃下储藏。

1.3.2 取样

定期（0d、30d.90d、180d）取样，将冻藏中华绒螯蟹置于4℃冰箱中解冻。解冻完成后，除去中华绒螯蟹中的不可食部分，取中华绒螯蟹腹部肌肉进行指标测定。

1.3.3 感官评价

由经过训练的10名感官评定员采用盲评计分方式分别从色泽、气味、质地3个方面对中华绒螯蟹进行评分，各指标的感官评价分值控制在0～9范围内，0分代表品质最差，9分代表品质最佳。每名感官评定员根据评定标准（表1）对中华绒螯蟹品质进行评分，取其平均值作为最终评定结果。

1.3.4 pH 的测定

将5 g蟹肉与45 ml水混合，匀浆，10000g离心15 min，测定pH。

1.3.5 失水率的测定

参照杨利艳等[12]的方法，略有改动。将冻藏的中华绒螯蟹在4℃下解冻12 h，用滤纸拭去表面水分并沥干，称质量。计算失水率，失水率=[（速冻前质量-速冻后质量）/速冻前质量]x100%。

1.3.6 盐溶性蛋白质的提取和测定

参照阴晓菲等[13]的方法提取盐溶性蛋白质。盐溶性蛋白质含量的测定采用双缩脲法。

1.3.7 MDA含量的测定

参照吴庆元等[14]的方法，略有改动。取一定量蟹肉，加入5倍体积去离子水，10000 r/min匀浆1 min，用于丙二醛含量的测定。用MDA测定试剂盒测定MDA含量。

1.3.8 Ca2+-ATPase活性的测定

使用超微量Ca2+-ATP酶活性试剂盒测定蟹肉Ca2+-ATPase活性。

1.3.9 总巯基（SH）含量的测定

参照彭欢欢等[15]和鲁耀彬等[16]的方法。取方法1.3.6 中提取的1 ml肌原纤维蛋白质（4 mg/ml），加入9.0 ml 0.2 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（含有8 mol/L脲，2%十二烷基硫酸钠和10mmol/L乙二胺四乙酸，pH6.8）混合，取4 ml混合液，加入0.4 ml0.1% 5，5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB），40℃水浴25min，在412 nm波长处测吸光值，用0.6 mol/L KCl（pH 7.0）溶液作为空白对照。计算总SH含量，SH含量=[（AXn）/（cxM）]x106，式中，A为412 nm处的吸光值，n为稀释倍数，c为摩尔吸光系数[其值为13600mol/（L.em）]，M为肌原纤维蛋白质量浓度（mg/ml）。

1.4 数据分析

用SAS（Statistics analysis system，Version 8.12）软件进行统计分析，方差分析采用ANOVA（Analy-sis of variance）分析，多重比较采用Duncan multiple-arrage test，差异显著性为P<0.05。

2 结果

2.1 冻结方式对中华绒螯蟹肌肉感官品质的影响

各冷冻处理的中华绒鳌蟹蟹肉感官指标评分均低于新鲜对照（表2），说明经过冷冻处理后，蟹肉的感官品质均下降。不同冻结方式对中华绒螯蟹肌肉的色泽、质地有显著影响（P<0.05），但对气味的影响较小;冻结温度越高，冻藏时间越长，肌肉色泽变化越明显，质地尤其是弹性越差。在相同储藏时间内，液氮速冻处理的蟹肉各项感官评分较高，与新鲜对照较为接近，其次是-70°C处理、-40℃处理和-20℃处理。以上结果说明，相同储藏条件下，冻结方式对蟹肉感官特性有显著影响。

2.2 冻结方式对中华绒螯蟹pH的影响

中华绒螯蟹适合生长在pH7～9的水环境中，本试验所用中华绒螯蟹的pH值为8.13左右。在冻藏过程中，各处理的pH值均呈下降趋势（图1）。-20℃和-40℃处理的pH值在冻藏初期下降明显，90d后pH值开始上升，并且-20℃处理的，上升速度高于-40℃处理。液氮处理的pH值变化最为平缓，其次是-70℃处理，180d后pH值分别为7.58和7.46，两处理在储藏90d后都没有出现明显的pH值上升的现象。

2.3 冻结方式对中华绒螯蟹失水率的影响

在冻结过程中，中华绒螯蟹内部形成大量的冰晶，细胞膜渗透压改变，细胞结构和组织破裂，解冻后冰晶融化，自由水和一部分结合水流失，最终导致汁液和营养物质流失。不同冻结方式下中华绒螯蟹失水率随着储藏时间的延长呈明显增加的趋势，各处理间差异显著（图2）。-20℃、-40℃、-70℃和液氮处理在储藏180d后，失水率由最初的1.06%分别上升到3.26%、2.81%、2.24%和1.81%，分别增加了2.08倍、1.65倍、1.11倍和0.71倍。因此，冻结温度越低，解冻后蟹肉失水率越低，持水力越高。

2.4 冻结方式对中华绒螯蟹脂肪氧化的影响

中华绒螯蟹蟹肉中不饱和脂肪酸含量占总脂肪含量的70%以上，油酸C18：1w9作为评价肉品质的重要指标之一，含量最高（22.39%～30.10%）[17]。由于蟹肉中不饱和脂肪酸含量高，因此在低温条件下也会发生氧化，对产品品质和货架期产生负面影响[8]。中华绒螯蟹初始MDA含量很低，约为0.29mg/kg（图3）。-20℃处理的MDA含量在贮藏前90d内持续快速上升，在90d時达到峰值（0.55mg/kg），随后缓慢降低。-40℃、-70℃和液氮处理的MDA含量变化较一致，在180d的贮藏期内均是持续增大。液氮处理的MDA含量最低（0.45 mg/kg），较冻藏初期仅增加了55%。

2.5 冻结方式对中华绒螯蟹盐溶性蛋白质含量的影响

盐溶性蛋白质，即肌原纤维蛋白质，是肌肉蛋白质的主要组成部分，对蟹肉品质起到关键作用。各处理的盐溶性蛋白质含量在前90d快速降低，随后下降速度减慢（图4）。速冻温度越高，蟹肉盐溶性蛋白质含量下降越明显。-20℃、-40℃、-70℃和液氮速冻处理在冻藏180d后，盐溶性蛋白质含量由最初的36.11 mg/g分别下降到14.03 mg/g.18.36 mg/g、22.69 mg/g、25.97 mg/g，分别下降了61.15%、49.16% 37.16%、28.08%。

2.6 冻结方式对中华绒螯蟹肌原纤维蛋白质总巯基含量的影响

巯基是肌原纤维蛋白质中活性最强的功能基团，在冻藏期间巯基易被氧化形成二硫键，导致巯基含量降低。冻藏前30d，各处理的总巯基含量下降速度较快，随后下降速度减缓。冻藏180d后，-20℃、-40℃、-70℃、液氮速冻处理的总巯基含量分别降低到初始值的52.71%、60.24%、65.36%、69.58%，说明在相同冻藏条件下，冻结方式对巯基氧化程度有显著影响，冻结温度越低，总巯基含量越高（图5）。

2.7 冻结方式对中华绒螯蟹Ca2+-ATPase活性的影响

各处理的Ca2+-ATPase活性在前90d降低明显，随后持续下降，但速度略有减慢（图6）。-20℃处理的降幅最大，180d冻藏期结束时剩余Ca2+-AT-Pase活性[0.57 μumol/（mg·min）]仅为新鲜样品的30.32%;其次是-40℃、-70°C处理，残留Ca2+-AT-Pase活性分别为0.81 μmol/（mg·min）和1.00μmol/（mg·min）;液氮速冻处理的下降趋势最为平缓，180d储藏期结束时，残留活性为1.18μmol（mg·min），为新鲜样品的62.77%。因此，冻结温度越低，Ca2+-ATPase活性越高。

3 讨论

水产动物停止呼吸后，体内糖原生成乳酸，导致肌肉pH值下降。但是，微生物代谢、蛋白质及其他含氮物质降解生成氨及胺类等碱性物质，又使肌肉pH值升高[19]。因此，pH值是评价肌肉新鲜度的重要参考指标。冻藏初期，中华绒螯蟹体内糖原生成乳酸，所有处理的pH值呈下降趋势。冻藏90d后，-20℃和-40℃处理的中华绒螯蟹体内出现微生物代谢活动，以及蛋白质在内源性组织蛋白酶作用下发生降解，生成碱性物质，pH值升高。-70℃和液氮处理在冻藏后期没有出现pH值明显升高的现象，说明超低温速冻能有效地抑制微生物生长，减缓蛋白质降解。屠冰心等[20]在研究低温冷冻对大黄鱼冻藏品质影响的过程中也发现，大黄鱼肌肉在冻藏过程中pH值总体呈先下降后上升的趋势。杨利艳等[12]认为液氮速冻的凡纳滨对虾pH值与新鲜的凡纳滨对虾最为接近，并且冻结温度越高，pH值越低。

中华绒鳌蟹体内液体流失主要是因为在冻结过程中冰晶的形成破坏了肌肉组织和细胞结构，而冰晶的形成与冻结时间有显著的相关性[15-16]。一般来说，0℃至-5℃的降温过程为最大冰晶生成带。在此期间，细胞外水分率先结晶，导致细胞外溶液离子浓度增大，造成细胞内溶液外移，继而形成更大的冰晶。冰晶挤压细胞，使细胞破裂，肌肉组织结构也被破坏，造成解冻后汁液流失增多。同时，蛋白质分子失去结合水，发生凝集，导致变性，最终引起肌肉品质下降[12]。因此，在冻结过程中，通过最大冰晶生成带所需要的时间越短，水产品体内形成的冰晶越小，对肌肉组织的破坏越小，产品品质越高。本试验中，与-20℃、-40℃和-70℃处理相比，液氮处理的温度极低，可以在最短的时间内通过最大冰晶生成带，使中华绒螯蟹中心温度在90s内达到-20℃，细胞内水分子来不及移动便形成了数量多且分布均匀的小冰晶，明显减弱了对组织结构的破坏，避免了大量蛋白质变性和营养成分的流失。本研究结果与杨利艳等[12]和Goncalves等[21]的报道一致，液氮速冻能够显著减少水产品的失水率，更好地保持产品风味和营养。随着冻藏时间的延长，4种冻结方式的失水率不断增大，原因是在冻藏期间，冰晶体积增大，加大了对肌纤维结构的破坏，更多的结合水转化为自由水门。

MDA是脂质过氧化作用的产物，其含量越高，说明脂肪氧化程度越高，酸败就越严重。MDA也是一种致癌物质[22-23]，所以MDA含量不仅能够作为水产品中脂肪酸败程度的评价指标，还能反映其食用安全性。在冻藏过程中，蟹肉中自由水含量减少，组织间隙液浓度增大，易导致脂肪氧化速度加快。本研究中，-20℃处理的MDA含量在90d时达到峰值，随后缓慢降低，原因可能是氧化产物醛、酮进一步降解，与蛋白质分解产物发生相互作用。MDA能与鱼肉中的氨基反应生产1-氨基-3-氨基丙烯，导致MDA含量下降[24]。彭欢欢等[15]研究发现，-20C速冻蟹肉贮藏12周时MDA含量达到最大值，之后MDA含量降低。-40℃、-70℃和液氮处理的MDA含量平稳上升，说明超低温速冻处理能够延缓蟹肉脂肪氧化，避免二级氧化产物的再次降解。

在中华绒螯蟹速冻过程中，蛋白质的部分结合水形成冰晶，使蛋白质分子间形成非共价键，进而形成不溶性大分子聚集体，导致蛋白质溶解性下降[25]。另外，巯基氧化后形成的二硫键会导致肌球蛋白重链聚合，引起蛋白质溶解性、营养品质下降[15-26]。从本试验结果中发现，在不同冻结方式下，中华绒螯蟹盐溶性蛋白质含量的下降趋势与总巯基含量的变化趋势存在明显相关性。说明中华绒螯蟹盐溶性蛋白质含量的下降在很大程度上是由巯基氧化形成二硫键所引起的。

蛋白质巯基活性较高，且对氧化反应比较敏感，因此巯基含量变化可以用于表征蛋白质氧化的程度。由于冰晶的形成，导致肌动球蛋白分子间的引力增强，但蛋白质分子与水分子的相互作用减弱，造成蛋白质空间结构发生明显变化，使埋藏在蛋白质分子内部的疏基暴露出来，进而被氧化成二硫键，引起疏基含量降低[2]。因此，速冻方式对巯基含量变化的影响极其显著。彭欢欢等[15]和阴晓菲等[13]分别研究了冻结方式对中华绒螯蟹和草鱼生化特性的影响，发现-60℃、-40℃冻结样品比-20℃冻结样品具有更高的盐溶性蛋白质和巯基含量，表明冻结温度越低，形成的冰晶越小，对肌原纤维蛋白质结构的破坏越小，这与本试验结果一致。本研究中各处理的巯基含量在前30d下降较快，可能是因为蛋白质分子外侧有大量的巯基，而这部分巯基在肌原纤维蛋白质不变性的情况下就能在储藏初期率先发生氧化。

Ca2+-ATPase活性源于肌球蛋白头部结构，是反应肌球蛋白完整性的重要参数[28]。冻藏期Ca2+-ATPase活性越高，则肌球蛋白的完整性越高，变性程度越低，肉品品质越高[2930]。在超低温冻结过程中，由于冰晶的形成伴随着肌肉中盐分浓缩，离子强度增加，致使肌球蛋白头部构象发生变化，进而使Ca2+-ATPase活性降低[31]。蛋白质分子间相互作用的增强导致蛋白质分子发生重排，肌球蛋白活性部位的巯基氧化也可能引起Ca2+-ATPase活性降低[13，32-33]。此外，冻藏期间肌球蛋白分子发生聚合，头部结构被掩盖，与ATP接触概率降低，催化ATP脱磷反应的活性也同时降低[34]。王阳光等[35]在研究速东方式对梭子蟹储藏期理化性质的影响中也发现，速冻温度越低，Ca2+-ATPase活性下降速度越慢。这与本研究结果一致，表明液氮速冻能更好地降低蟹肉蛋白质的变性程度。

综上所述，冻结方式对中华绒螯蟹蟹肉生化特性和感官品质有显著影响。更低的冻结温度能更有效地减缓蛋白质变性和脂肪氧化。与-20℃、-40℃和-70℃速冻处理相比，液氮速冻方式可以最大限度地保持中华绒螯蟹蟹肉的品质，特别适用于中华绒螯蟹的储藏、运输和加工。

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