UPLC-MS测定千金子提取物的活性成分及其抗氧化性研究

郭高平

摘 要：目的：鉴定千金子乙醇提取物化学组成，探究其抗氧化活性，筛选活性化合物。方法：基于超高效液相色谱-飞行时间质谱（UPLC-TOF-MS），数据库检索和文献比对等手段对其活性成分进行分析;采用DPPH和ABTS自由基清除法、β-胡萝卜素漂白法对提取物进行抗氧化活性评价。结果：共鉴定出17个化合物，包括青蒿亭、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷、蔓荆子黄酮4个黄酮类化合物，瑞香素和双七叶内酯2个香豆素类化合物;千金子乙醇提取物对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力远大于BHT;对β-胡萝卜素的漂白作用弱于BHT。结论：千金子乙醇提取物中含有较丰富的水溶性黄酮类化合物和香豆素类化合物，表现出一定的抗氧化活性。

关键词：千金子;超高效液相色谱-飞行时间质谱;活性成分;抗氧化活性

千金子（Euphorbia lathyris）为大戟科植物续随子的干燥成熟种子[1]，广泛分布于吉林、河南、浙江、四川等省[2]，其性温，味辛，逐水消肿、破血消癥，用于治疗水肿、痰饮、积滞胀满、二便不通、血瘀经闭，外治顽癣、疣赘[3]。目前对千金子的研究多限于其化学成分的分离与鉴定，发现其化学成分有二萜醇及其酯类、甾醇、香豆素类、黄酮类、挥发油、脂肪油及少量其他化合物[4-7]。自由基是机体氧化反应产生的有害化合物，过量的自由基对机体有损伤效应，与炎症、肿瘤等疾病密切相关。千金子含有二萜醇、甾醇、香豆素类和黄酮类化合物，也应表现出较强的抗氧化活性[8-10]，但未见对其抗氧化活性的报道。基于此，本文利用高分辨质谱鉴定千金子中化学成分，采用DPPH[11-12]和ABTS自由基清除法[13]，以及β-胡萝卜素漂白法[14-15]对千金子乙醇提取物抗氧化活性进行测定，再筛选出抗氧化活性化合物，为千金子资源的综合利用、深度开发提供一定的理论和物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 试验材料 千金子（河南禹州，中国）;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）、β-胡萝卜素（上海阿拉丁试剂公司，中国）;2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（上海阿拉丁试剂公司，中国）;亚油酸（上海阿拉丁试剂公司，中国）;维生素C（天津市科密欧化学试剂有限公司，中国）;过硫酸钾（K2S2O8）（成都市新都区木兰镇工业开发区，中国）;其余试剂均为分析纯。

1.1.2 试验仪器 超高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC I-Class）、四级杆飞行时间质谱（Xevo G2-S QTof Mass Spectrometer，Waters公司）、UV-1800PC型紫外可见分光光度计（上海翱艺仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 药材处理 600g干燥的千金子药材粉碎，加入乙醇冷浸提取，浸泡12h后超声30min，循环此操作3d，取上清液。重复5次合并上清液，减压浓缩，得千金子粗提物总浸膏50g，放置于4℃的冰箱待用。

1.2.2 UPLC-MS条件

（1）色谱条件：色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1mm×50mm，1.7μm）;流动相：A，甲醇;B，0.1%（V/V）甲酸水溶液;梯度洗脱：0～3min，20%～80% A;4～11min，80%～90% A;12～15min，90%～40% A;15～17min，40%～20% A;进样量：3μL;流速：0.3mL/min;柱温：45℃。

（2）质谱条件：电喷雾电离源（ESI），正离子分辨率模式;毛细管电压：2.5kV;样品锥孔电压：40V;萃取锥孔电压：50V;温源：100℃;脱溶剂温度：800℃;锥孔气：50L/h;脱溶剂气流速：800L/h。

1.3 千金子乙醇提取物的抗氧化活性研究

1.3.1 DPPH和ABTS自由基清除法

（1）参照Larrauri等[16]的方法，以BHT作为阳性对照。配置质量浓度分别为0.004、0.006、0.008、0.010、0.015、0.020、0.040、0.060、0.080mg/mL的千金子提取物乙醇溶液。各取2mL于10mL EP管，加入2mL浓度6.086×10-5mmol/L DPPH乙醇溶液为样品组。对照组为2mL BHT溶液和2mL DPPH的混合溶液;各组溶液混合均匀后，避光反应30min，无水乙醇调零，于517nm下测定对照组和样品组的吸光度。自由基清除率计算公式为式（1）：

（2）参照Tovar-Barrios[17]和李培源等[13]的方法，将等体积7.4mmol/L ABTS水溶液与2.6mmol/L K2S2O8水溶液混合，避光放置16h，得到ABTS+溶液。使用前将ABTS+溶液用磷酸盐缓冲液稀释成工作液（在734nm下吸光度为0.70±002）。分别移取0.010、0.020、0.030、0.040mg/mL的千金子乙醇提取物溶液各1mL于EP管中，加入4mL ABTS+溶液。在1、3、5、10min时测定其吸光值。ABTS+清除率（S）计算公式为式（2）：

1.3.2 β-胡萝卜素漂白试验 参照陈小强[14]和詹济华等[15]的方法，对千金子乙醇提取物对β-胡萝卜素-亚油酸氧化体系的抑制效果进行测定。将2.5mg β-胡萝卜素溶于5mL氯仿中，加入0.25g亚油酸及4.0g吐温。混合均匀后50℃水浴除去氯仿;加入50mL热蒸馏水，超声震荡配置成反应介质溶液。以不加β-胡萝卜素溶液为空白调零。对照组以0.2mL乙醇和5mL反应介质溶液，样品组为0.2mL样品液和5mL反应介质溶液，阳性对照组为0.2mL BHT和5mL反应介质溶液。各组在50℃下孵育30min，于470nm处测定吸光度，每5min測定1次，直至对照组颜色完全消失。抗氧化活性计算公式[18]为式（3）：

2 结果与分析

2.1 千金子提取物液质联用分析条件选择

分别采用正、负离子模式对千金子提取物进行分析，经过流动相、色谱条件的优化得到最佳条件，在该条件下千金子提取物中的特征峰得到了良好分离，峰型较好（图1）。

x2.2 化合物鉴定

经UPLC-MS分析，共检测到39个色谱峰，依据各色谱峰的分子离子峰及主要碎片峰的解析，通过数据库搜索、文献对照，确定了千金子乙醇提取物中的17个化合物。从表1可以看出，千金子中含青蒿亭、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷和蔓荆子黄酮4个黄酮类化合物，瑞香素和七叶内酯2个香豆素类化合物。上述物质具有一定的抗氧化活性[19-20]。

2.3 DPPH和ABTS清除自由基试验

如图2a所示，随着千金子乙醇提取物浓度的增加，DPPH清除率逐渐升高，当浓度大于0.020mg/mL时，清除率可達90%以上。通过描点法测得千金子乙醇提取物半数清除率IC50为0.012mg/mL，BHT的半数清除率为0.016mg/mL。表明千金子乙醇总提取物的活性优于BHT。当千金子提取物浓度从0.01mg/mL增加至0.04mg/mL时，ABTS自由基清除率从32%增加至95%以上（图2b），而BHT对ABTS自由基的清除率从5%增加至42%（图2c）。上述结果说明在相同浓度下千金子提取物抗氧化能力远优于BHT。

图2 a DPPH反应体系中千金子提取物变化曲线;b DPPH反应体系中BHT的标准曲线;c ABTS反应体系中千金子提取物;d BHT抗氧化性比较

2.4 β-胡萝卜素漂白试验

如图3所示，无论加入千金子乙醇提取物，还是BHT，随着反应的进行，溶液吸光度逐渐减小，直至消失。2.0mg/mL的千金子乙醇提取物和BHT的抗氧化活性分别为5.15%和12.22%，这说明千金子乙醇提取物的抗氧化活性要弱于BHT。结合清除自由基试验结果，说明千金子乙醇提取物中具有抗氧化活性的组分多为水溶性化合物[21]。

3 结论

本文对千金子乙醇提取物采用UPLC-TOF-MS，共鉴定包括4个黄酮类化合物（青蒿亭、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷、蔓荆子黄酮）和2个香豆素类化合物（瑞香素和双七叶内酯）在内的17个化合物。抗氧化活性试验结果表明，千金子乙醇提取物对DPPH和ABTS自由基的清除率优于BHT，对β-胡萝卜素的漂白能力次于BHT。这与千金子中含有较多水溶性的黄酮类和香豆素类化合物直接相关。UPLC-TOF-MS鉴定结果也验证了该结论的可靠性。本研究可为千金子中天然抗氧化剂的开发利用提供一定的科学依据。◇

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