鸭源1:A 型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

程增青，郭玉广，马 冬，赵永军，范根成

（1. 青岛易邦生物工程有限公司，动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266032；

2. 尉氏县永军兽药技术服务部，河南尉氏 475500）

多杀性巴氏杆菌可以引起多种畜禽巴氏杆菌病，如牛出血性败血症、羊出血性肺炎、禽霍乱、猪萎缩性鼻炎、兔传染性鼻炎等[1]。2018 年9 月，河南省某大型蛋鸭场发生疑似巴氏杆菌病。鸭群整体精神、采食正常，但产蛋率下降至90%以下。巴氏杆菌病多呈慢性感染，急性败血型死亡少见，鸭感染后常表现缩头垂翅，头颈无力，最后瘫痪并死亡，死亡率约0.5%。剖检该蛋鸭场病鸭，可见巴氏杆菌病典型病变，如心冠脂肪、心包有出血点，肝脏肿大、质脆，有出血点，胰腺边缘、脾脏、卵巢坏死，卵泡呈“煮熟样”坏死，肠道出血、黏膜脱落，有脓性带血的内容物。对病鸭肝脏进行细菌分离，获得一株疑似多杀性巴氏杆菌菌株，经对其进行一系列鉴定，证实其为1:A型多杀性巴氏杆菌。

1 材料

病料：来源于河南省尉氏县某蛋鸭场；营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、含5%小牛血清的TSA/TSB 培养基：均由青岛易邦生物工程有限公司提供；细菌微量生化鉴定管、药敏纸片：均购自杭州微生物试剂有限公司；昆明小鼠：体质量25 g 左右，购自济南山大实验动物中心；Premix Ex Taq、DL 2 000 核酸Marker：均购自大连宝生物（TaKaRa）有限公司；引物：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他仪器、试剂，均由青岛易邦生物工程有限公司提供。

2 方法

2.1 细菌分离

取病死鸭肝脏，无菌操作，接种于含5%小牛血清的TSA 琼脂平板，置37 ℃培养箱中培养24 h。

2.2 细菌鉴定

2.2.1 形态观察 挑取疑似菌落，经革兰氏和瑞氏染色后镜检，观察其形态。

2.2.2 培养特性鉴定 挑取疑似菌落分别接种营养琼脂、麦康凯琼脂、含5%小牛血清的TSA 琼脂及含5%小牛血清的TSB 培养基，置37 ℃培养24 h，观察其生长特性。

2.2.3 生化特性鉴定 麦芽糖、甘露醇、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、乳糖、蔗糖、脲酶试验、硫化氢试验、MR 试验、接触酶试验和吲哚试验生化鉴定，均参照使用说明书进行。

2.2.4 PCR 鉴定及分型 挑取疑似菌落，用100 μL 纯水重悬后，煮沸5 min，以此作为模板，利用引物进行PCR 鉴定及分型鉴定。多杀性巴氏杆菌特异性引物参考Townsend 等[3]方法合成，用于扩增多杀性巴氏杆菌kmt 基因，扩增片段长度为457 bp；荚膜分型引物同样参考Townsend 等[3]方法合成，用于扩增多杀性巴氏杆菌A、B、D、E、F荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD，扩增片段长度分别为1 044、760、657、511、851 bp；脂多糖分型引物参考Harper 等[4]方法合成，用于扩增多杀性巴氏杆菌LPS1～8 型外核编码簇上不同的基因位点，扩增片段长度分别为1 307、810、474、120、1 175、668、931、255 bp。以上PCR 反应体系均为：Premix Ex Taq 12.5 μL，引物F 0.5 μL，引物R 0.5 μL，模板2 μL，无离子水9.5 μL。反应程序均为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，54 ℃ 15 s，72 ℃ 65 s，30 个循环；72 ℃ 5 min；16 ℃ ∞。

2.3 毒力试验

挑取典型菌落，接种于含5%小牛血清的TSB培养基，37 ℃振摇培养16 h，用生理盐水进行10倍系列稀释，取10-7稀释度菌液涂布含5%小牛血清的TSA 琼脂平板并进行活菌计数，0.1 mL/板，涂2 板；取10-6、10-7、10-8、10-9稀释度菌液，分别按0.2 mL/只剂量，腹腔注射体质量25 g 左右昆明小鼠4 只，观察小鼠死亡情况。

2.4 药敏试验

挑取典型菌落，密集划线接种于含5%小牛血清的TSA 培养基，贴上头孢哌酮舒巴坦钠、头孢曲松钠、头孢噻肟、环丙沙星、左氧氟沙星、强力霉素、丁胺卡那、氟苯尼考、林可霉素等药敏纸片，置37 ℃培养箱中培养24 h，然后测量不同药敏片抑菌圈直径大小，确定药物敏感性。按照不同抗菌药标准，对比抑菌圈直径大小，结果评定为高敏、中敏和不敏感。

3 结果

3.1 形态观察及培养特性鉴定

分离菌为革兰氏阴性小杆菌，多单在，部分菌体两端浓染。在营养琼脂上生长贫瘠，在麦康凯琼脂上不生长；在含5% 小牛血清TSA 琼脂上生长良好，37 ℃培养24 h，能形成圆形、边缘整齐光滑、半透明的灰白色菌落，菌落直径为2～3 mm；接种含5%小牛血清TSB 中培养24 h 后，发现呈均匀一致浑浊，管底有少量沉淀，无菌膜。

3.2 生化特性

分离菌不能发酵鼠李糖、乳糖，能发酵麦芽糖、甘露醇、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖和蔗糖，产酸不产气；脲酶试验、MR 试验结果为阴性，接触酶试验结果为阳性，硫化氢试验、吲哚试验结果为阳性。

3.3 PCR 鉴定及分型鉴定

分离菌用多杀性巴氏杆菌特异性鉴定引物能扩增到547 bp 的目的基因片段（图1），用多杀性巴氏杆菌荚膜型和LPS 型特异性引物进行扩增，发现荚膜A 型引物和LPS1 型引物能分别扩增到1 044、1 307 bp 的基因片段，其余引物均未能扩增到预期大小的基因片段（图2）。

M. DL 2 000 bp DNA Marker；1. 分离菌；2. 阴性对照。图1 多杀性巴氏杆菌特异性鉴定引物扩增结果

M. DL 2 000 bp DNA Marker；1. Pm-LPS1；2. Pm-LPS2；3. Pm-LPS3；4. Pm-LPS4；5. Pm-LPS5；6. Pm-LPS6；7. Pm-LPS7；8. Pm-LPS8；9. Pm-A；10. Pm-B；11. Pm-D；12. Pm-E；13. Pm-F。图2 分离菌荚膜型和LPS 型鉴定结果

3.4 药敏试验

药敏试验结果显示，分离菌对头孢噻肟、头孢曲松钠、左氧氟沙星高度敏感，抑菌环直径分别为25、25、22 mm；对强力霉素、环丙沙星、头孢哌酮舒巴坦钠、丁胺卡那中度敏感，抑菌环直径分别为20、18、16、16 mm；对氟苯尼考、林可霉素不敏感，抑菌环直径分别为13、10 mm。结果详见图3。

3.5 毒力试验

图3 分离菌药敏试验结果

活菌计数结果显示，攻毒菌液原液的活菌含量 为1.85×109CFU/mL，10-6、10-7、10-8、10-9稀释度菌液攻毒组的攻毒菌量分别为370、37、3.7、0.37 CFU/（0.2 mL/只）。毒力试验结果显示，所有10-6、10-7、10-8稀释度菌液攻毒组小鼠均于攻毒后24 h 内全部死亡，10-9稀释度菌液攻毒组小鼠于攻毒后7 d 内全部健活。结果详见表3。

表3 分离株对小鼠的毒力试验结果

4 分析与讨论

经形态、培养特性和生化特征鉴定，初步确定该分离菌为多杀性巴氏杆菌。参考文献[3-4]方法，用PCR 进行多杀性巴氏杆菌特异性鉴定、荚膜型及菌体型（LPS 型）鉴定，证明该分离株为1:A 型多杀性巴氏杆菌，与国内学者研究得出的禽源多杀性巴氏杆菌主要为1:A 型的结论一致[5]。相对于传统的基于抗原抗体反应的荚膜型和菌体型鉴定，PCR 方法具有快速、准确、操作简单的优点，尤其是对于难以获得标准鉴定血清的研究。国内也有多位学者应用PCR 分型的方法对多杀性巴氏杆菌进行了分型研究[5-6]。

目前国内学者对鸡源巴氏杆菌的研究报告较多，但对鸭源的研究报告较少。本次病例中，鸭群整体精神、采食正常，产蛋率下降不明显，死亡率也不高，但呈现持续的慢性感染和死亡，造成较大经济损失。分离菌被确诊后，根据药敏试验结果，选择头孢噻肟拌料，饲喂3 d 后，死亡现象停止。

虽然本次病例没有出现较高的死亡率，但分离的鸭源多杀性巴氏杆菌对小鼠具有较高的毒力，3.7 CFU 即能致死全部攻毒小鼠。这是否说明多杀性巴氏杆菌对鸡、鸭、鼠等不同动物具有不同的易感性，还有待于对以上几种动物进行毒力对比试验来进一步验证。