口岸截获猪肉肠的主要猪病病原核酸检测

2019-09-09李碧鹰高志强肖国英

中国动物检疫 2019年9期

李碧鹰，高志强，汪琳，肖国英，蒲静，高静，

赵相鹏2，尹羿2，任彤2，张伟2

（1.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100000；2.北京海关，北京 100026）

根据《中华人民共和国禁止携带、邮寄进境的动植物及其产品名录》规定，（生或熟）肉类（含脏器类）及其制品，均属于禁止携带、邮寄进境物。从境外携带的动物产品，由于其原料信息、制作工艺不明，存在散播动物疫病风险，一旦接触易感动物，很有可能引起动物疫情。但近年来非法携带动物产品屡禁不止，给我国动物疫病防控带来巨大风险。随着猪肉及其制品国际贸易的发展以及进出境旅客的非法携带，猪病病原跨境传播风险也随之加剧。例如从2007 年开始，非洲猪瘟从撒哈拉沙漠以南传遍整个东欧，2018 年又从高加索地区传入亚洲多个国家，引起多国非洲猪瘟暴发和国际贸易限制。此外，近十多年来，频发的食品安全问题使得世界各国对食品安全十分关注。而一些猪病病原还会引起公共卫生问题，例如2009 年的H1N1 亚型猪流感，经溯源表明其来源于猪群中流行的毒株[1]。

根据我国与其他国家的双边贸易协定规定，口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV），猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome disease virus，PRRSV），猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV），猪圆环病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV-2），猪流感病毒（swine influenza virus，SIV），猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV），伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV），猪细环病毒1 型和2 型（torque teno sus virus 1 and 2，TTSuV1 and TTSuV2）8 种病毒，被列为进出境可能通过猪肉传播的检疫对象。FMDV、CSFV 和PRRSV 为可严重危害养殖业的重大疫病，已被世界各国列为重点防控对象。而SIV、PRV、PCV-2、PPV 以及TTSuV1 和 TTSuV2 为分布范围较广的病原，从肉制品中检出的可能性较高。为了解非法跨境携带猪肉肠传播动物疫病的风险，从而为执法部门的监督管理提供数据支持，本文以北京口岸截获的猪肉肠为研究对象，选取282 份样品进行了8种猪病病原核酸的检测分析。

1 材料与方法

1.1 样品

样品均为口岸截获的猪肉肠核酸样品，-80 ℃冰箱保存。按照猪肉肠接收时间将样品分为“前段（2018 年11—12 月）、中段（2019 年1—2 月）和末段（2019 年3—4 月）”，从每个时间段样品中随机抽取94 份，共抽取282 份核酸样品。样品主要来自25 个国家的航班，其中欧洲16 个、非洲7 个、亚洲2 个，另有3 份样品来源国未知。具体猪肉肠样品来源信息见表1。

表1 猪肉肠样品来源信息统计

1.2 设备与试剂

荧光PCR 仪、Roche 480：美国Roche 公司产品；AB QuantStudioTM5：美国Thermo Fisher 公司产品；病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒：天根生化科技有限公司产品；引物、探针：生工生物工程股份有限公司合成；M-MLV 反转录酶、RNA酶抑制剂：Promega 公司产品；Ex Taq®Hot Start Version、dNTP：TaKaRa 公司产品。

1.3 检测方法

8 种病原的检测方法主要是荧光PCR、荧光RT-PCR，均依据相关国际/国家标准或规范进行，具体见表2。

表2 8 种病原的检测方法及依据

2 结果与分析

2.1 总体检测情况

在282 份猪肉肠中，PCV-2、PPV、PRV 以及TTSuV1 均有检出，其中TTSuV1 和PCV-2 检出率最高，平均阳性检出率分别为41.49%和40.43%，其次是PPV，检出率为36.17%，PRV 检出率较低，为3.90%，而FMDV、PRRSV、CSFV、SIV 以及TTSuV2 的检出率为0，检测结果均为核酸阴性。具体检测结果见表3。

2.2 阳性样品来源分布

由表3 可以看出，在已知来源的样品中，来自20 个国家的样品均检出了病原，其中：检出4种疫病病原核酸的国家有4 个，分别为俄罗斯、立陶宛、蒙古国和乌克兰；检出3 种的11 个，分别为白俄罗斯、保加利亚、波兰、赤道几内亚、德国、法国、捷克、西班牙、匈牙利、意大利、赞比亚；检出2 种的3 个，分别为津巴布韦、拉脱维亚、南非；检出1 种的2 个，分别为比利时和罗马尼亚。从阳性样品来源分布可以看出，阳性样品主要来自欧洲地区，共有15 个国家，其次是非洲地区，共有4 个国家，来自亚洲的最少，仅有1 个。

表3 猪肉肠阳性检出情况

3 讨论

本研究以北京口岸截获的猪肉肠为目标，抽取282 份样品进行了8 种猪病病原的核酸检测，未检出FMDV、PRRSV、CSFV 以及SIV 等动物疫病病原。检出了PCV-2、PPV、PRV 以及TTSuV1病原核酸，其中TTSuV1 和PCV-2 检出率均在40%以上，PPV 检出率在35%以上，阳性率较高，表明这3 种病原随非法携带的猪肉肠进入国内的风险较高。

TTSuV 是一种小的无囊膜的单链环状DNA 病毒，首次报道于1999 年，但追溯分析显示在1985年该病原就可能在猪场传播。此后，各国报道本病原在猪场的阳性率在24%∼100%。PCR 检测研究显示，该病原可存在于猪的血清、血浆、精液、粪便、初乳以及鼻腔分泌物中[5]。目前还没有在猪肉制品中检测TTSuV1 的报道。本研究首次在猪肉肠中检出了TTSuV1，并且在欧、亚、非国家截获的猪肉肠中均有检出，表明其分布范围很广。目前关于TTSuV 对猪的危害尚不清楚，因此需要进行监测预警。

PCV-2 是一种严重影响养猪业的猪病病原，呈全球性分布，具有多种基因型，世界各国均有报道。PCV-2 通常分布于淋巴组织、骨髓以及心脏组织中，肌肉和各种脏器中均可能存在感染性病毒[6]。研究表明，该病毒对低pH 以及加热有一定的抵抗力，未煮熟的猪肉、组织及其制品一旦进入猪饲料，病毒可经胃肠道摄入而感染。肉肠的加工中，为保持其风味，其中的肉糜往往未彻底熟制，因此导致PCV-2 在肉肠中的检出率较高。

PPV 呈世界性分布，是引起母猪繁殖障碍的首要病因，其对热和酸碱度具有较强抵抗力，在56℃/48 h 或70℃/2 h 对病毒的感染性不会明显改变，在pH3.0～ 9.0 环境中稳定[6]。PPV 能够在猪舍环境中存活数月之久，从而引起猪群的持续性感染传播[6]。本检测发现，PPV 阳性率达36.17%，表明该病毒抵抗力较强，可在猪肉肠中广泛存在。

PRV 可引起猪等多种动物感染。近十多年来，随着一些国家根除计划的实施，很多发达国家的猪场，比如欧洲国家，都根除了PRV。本检测检出的PRV 阳性样品主要见于俄罗斯、蒙古国及个别欧洲国家，因而该病毒的检出率相对偏低。尽管如此，PRV 在全球大部分国家的野猪、杂交猪中仍广泛存在。研究表明，PRV 可通过污染的肉制品传播[6]，所以仍需加强境外携带猪肉肠的PRV检测。