基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法的兴安升麻甲醇提取物化学成分分析

吕 弘，王晓明,*，刘小梅，张 帆，王献瑞，郭亚卿，潘桂湘*

（1.天津中医药大学 天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津 301617；2.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250）

兴安升麻（Cimicifuga dahurica(Turcz.) Maxim）是毛茛科升麻属多年生宿根草本植物，又称北升麻、窟窿牙根、苦老菜根[1]，主产于我国华北、东北地区。兴安升麻幼苗可食，根茎为药用有效部位，即为升麻[2]。2015年版《中国药典》记载，升麻具有发表透疹、清热解毒、升举阳气等功效，用于风热头痛、口疮、麻疹不透、阳毒发斑、子宫脱垂等病证[3]。升麻属植物目前发现主要含有9,19-阿尔廷烷三萜皂苷、肉桂酸衍生物等两大类化合物，此外还有色原酮类、吲哚类生物碱以及其他含氮类化合物[4-5]。其药理作用除了传统的抗炎[6]、解热、镇痛和抗溃疡外[7]，还可用于治疗妇女绝经、骨质疏松[8-9]、肿瘤[10]等。

升麻可以鲜食，既是药膳佳肴又是食材良药。早春可将幼嫩的升麻茎制作后食用，清香爽口，略带苦味，若与小米粥同食，可变苦为甜；幼叶凉拌菜、炒菜或用作主食菜馅，有较高的食用价值[11]。国家卫生健康委（原卫生部）曾于2002年3月发布《卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知》文件，将升麻列入可用于保健食品的原料清单。

本实验利用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）较佳的色谱分离特性和四极杆-飞行时间（quadrupole-time of flight，Q-TOF）良好的质量分辨能力[12]，及亚2 μm填料窄径柱优越的色谱分离能力，使兴安升麻甲醇提取物的众多成分在色谱上得到较好分离，然后用Q-TOF-质谱（mass spectrometry，MS）采集一级、二级高分辨质谱数据，接着利用Masshunter软件对原始质谱数据进行分析，根据获得的化合物精确质量数、色谱保留时间、碎片离子信息等，对兴安升麻的化学成分进行解析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

升麻药材购于河北安国药材市场，天津中医药大学李天祥教授鉴定为兴安升麻。

对照品：北升麻瑞、北升麻宁、升麻酰胺A、反式阿魏酰酪胺-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、(＋)-异落叶松脂素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、24-epi-7,8-双去氢升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷均为自制，经红外光谱、核磁共振、质谱鉴定，质量分数大于98%；咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、升麻素、升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷 中国药品生物制品检定研究院。

乙腈、甲醇（均为色谱纯） 美国Fisher公司；甲酸（色谱纯） 美国Tedia公司；超纯水由Milipore超纯水净化系统制得。

1.2 仪器与设备

1290 UPLC仪、6520 Q-TOF-MS仪 美国Agilent公司；Mill-Q II型超纯水器 美国Millipore公司；3K15低温高速离心机 德国Sigma公司；AX205十万分之一天平瑞士Mettler Toledo公司；KQ-250E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；XW-80A旋涡混合器 上海沪西分析仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

供试品：将升麻药材样品粉碎，过40 目筛后精密称取0.25 mg置于10 mL容量瓶，精密加入9.75 mL 80%甲醇，盖塞超声提取（功率250 W，频率40 kHz）30 min，静置放冷至室温后，80%甲醇溶液补足至刻度，摇匀，滤纸过滤，取续滤液1 mL于14 000 r/min离心10 min，将上清液再用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

1.3.2 UPLC条件

色谱柱：Waters Acquity BEHC18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；保护柱：Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；柱温30 ℃；流速0.4 mL/min；进样量1 μL；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序见表1。

表1 色谱梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure for chromatographic separation

1.3.3 MS条件

电喷雾离子源；涡轮喷射，正负离子模式检测，质量扫描范围m/z100～1 000。离子源参数：喷雾电压3 500 V，碎裂电压175 V，离子源温度350 ℃，鞘气流速10 L/min；喷雾气压力35 psi；锥孔电压65 V。

1.3.4 高分辨质谱数据处理、检索和鉴定

利用Masshunter工作站中的MFE软件，通过设定合适的阈值参数，对升麻甲醇提取物正负离子模式下采集到的原始质谱数据进行分子特征提取，得到精简的质谱数据信息。然后将精简后的特征离子导入到自定义化合物数据库中。该数据库收集了文献已报道升麻化学成分的化合物名称、CAS号、分子式、精确质量数、化学结构式等相关信息，由PCDL软件编辑而成。在数据库中执行Batch Search（批处理检索）操作，检索得到可能与升麻相关的候选成分，接着根据质谱裂解规律，对二级质谱碎片进行解析，推测化合物的结构，并辅以部分标准品的确证，鉴定升麻甲醇提取物中的主要化学成分。

2 结果与分析

2.1 提取方法及色谱条件的选择

提取方法的选择：考察不同超声时间，不同比例的甲醇溶液（40%、60%、80%、100%）的超声提取效果，将色谱峰的数量和响应强度作为考察指标，最终确定提取时间为40 min，提取溶剂为80%甲醇溶液。

色谱柱的选择：实验比较了C18、HSS T3不同类型色谱填料，5、1.7 μm不同填料粒径，50、100 mm色谱柱长度，4.6、2.1 mm色谱柱内径的色谱分离情况，结果显示Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱峰容量大、色谱分离效果最佳。

流动相的选择：在色谱条件筛选过程中，实验比较了乙腈溶液与甲醇溶液的分离效果，结果表明乙腈溶液的分离效果更好；继而又对乙腈-0.05%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液的分离效果进行对比，结果表明当流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液时，色谱分离效果最好。

2.2 兴安升麻化学成分色谱峰的鉴定

图1 兴安升麻UPLC-Q-TOF-MS正（A）、负（B）总离子流色谱图Fig. 1 UPLC-Q-TOF-MS total ion current (TIC) chromatograms of chemical components from C. dahurica in positive and negative ion modes

依据供试品的色谱保留时间、碎片离子峰等信息，结合质谱裂解规律和部分标准品确证，从兴安升麻甲醇提取物中共鉴定了38 个化合物，其中19 个于正离子模式下检测，另19 个在负离子模式下检测到，见图1、表2。

2.3 化合物的MS解析

2.3.1 苯丙素类

鉴定苯丙素类化合物共18 个，其中苯丙素苷2 个、木质素1 个，咖啡酸类15 个，分别为表2中的化合物2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、17、20、21、22、23和24。

化合物4、5均失去一个氢离子得到母离子m/z 315.107 3 [M－H]－，在二级质谱中检测到m/z 161、153 [M－H－162]－，保留时间分别为5.11 min和5.88 min，其裂解过程为准分子离子丢失一分子六元含氧糖生成苷元碎片离子。通过与自制的北升麻瑞、北升麻宁标准品对照，含半乳糖化合物出峰时间早于含葡萄糖的化合物，根据文献[15-16]数据确定化合物4为北升麻瑞，化合物5为北升麻宁，均为苯丙素苷类化合物，裂解途径如图2A所示。

化合物1 1失去一个氢离子得到母离子m/z 521.204 2 [M－H]－，其保留时间为14.59 min，检测到二级碎片离子m/z 359 [M－H－162]－、161，结合碎片离子质量推测其裂解过程为准分子离子m/z 521.204 2失去葡萄糖中性碎片，得到m/z 359、161的碎片离子峰，裂解途径如图2B所示，与(＋)-异落叶松脂素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷标准品进行对照，确定化合物11为(＋)-异落叶松脂素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，是升麻属中首次分离得到的木质素类化合物。

化合物7失去一个氢离子得到母离子m/z 179.035 3 [M－H]－，丰度较高，其保留时间为8.08 min，在二级质谱中检测出m/z 135，根据文献[17]推测其裂解途径为准分子离子脱去一分子CO2得到碎片m/z 135 [MH－44]－，裂解途径如图2C所示，与咖啡酸对照品一致，确定化合物7为咖啡酸。

化合物8、12均失去一个氢离子得到母离子m/z 193.05 [M－H]－，二级质谱中均检测到m/z 178、134的碎片离子，保留时间分别为12.96 min和14.61 min，因2 个成分质谱数据完全相同，所以互为同分异构体。根据文献[18]推测其裂解途径，为准分子离子丢失一分子CH3•，形成m/z 178的碎片离子，再失去一分子CO2，生成m/z 134 [M－H－15－44]－的碎片离子。通过与阿魏酸、异阿魏酸标准品进行对照，确定化合物8为阿魏酸，化合物12为异阿魏酸。阿魏酸的裂解途径如图2D所示，异阿魏酸的裂解规律与阿魏酸相似。

化合物9失去一个氢离子得到母离子m/z 609.144 3[M－H]－，其保留时间为13.23 min，特征碎片离子为m/z 253、178、163、134，根据文献[14]推测其裂解途径可能是m/z 609.144 3丢失一分子六元糖基碎片得到苷元碎片，苷元碎片再失去一分子咖啡酸及一分子H2O，得到m/z 253、178 [C9H8O4－H]－的碎片离子，碎片m/z 178分别失去一分子CH3•和一分子CO2，分别得到碎片m/z 163、134。根据文献[14]数据推断化合物9可能为咖啡酸类衍生物shomaside A。

表2 UPLC-Q-TOF-MS在正、负离子模式下鉴定兴安升麻中化学成分Table 2 Compounds identi fi ed in C. dahurica by UPLC-Q-TOF-MS in both negative and positive ion modes

化合物13、14均失去一个氢离子得到母离子m/z 593.15 [M－H]－，二级质谱检测出碎片离子均为m/z 253、178、163、134，保留时间分别为14.96 min和15.36 min，裂解途径与shomaside A相似，推测二者母核相同但糖基种类不同，鉴于含半乳糖化合物出峰时间早于含葡萄糖的化合物，结合质谱数据推断化合物13可能为shomaside B，化合物14可能为shomaside C。

化合物1 7失去一个氢离子得到母离子m/z 433.075 9 [M－H]－，其保留时间为16.60 min，在二级质谱中检测出m/z 271、179、135碎片离子，根据参考文献[14,20]推测其裂解途径为m/z 433.075 9失去一分子咖啡酰氧基得到碎片m/z 271 [M－H－C9H7O3]－，碎片m/z 179 [C9H8O4－H]－失去一分子CO2得到m/z 135的碎片离子，根据文献[14,20]推测化合物17可能为蜂斗菜酸。

化合物21、22均失去一个氢离子得到母离子m/z 447.092 4 [M－H]－，均检测出二级碎片离子m/z 253、235、194，m/z 253碎片丰度峰较高，保留时间分别22.28 min和24.27 min。结合文献[20]推测出准分子离子丢失一分子阿魏酸/异阿魏酸的中性碎片，得到m/z 253 [M－194]－碎片离子，碎片m/z 253进一步裂解丢失一分子H2O得到碎片m/z 235，依据文献[20]质谱数据推断化合物21可能为升麻酸A，化合物22可能为升麻酸B。

化合物23、24均失去一个氢离子得到母离子m/z 431.096 7 [M－H]－，二级质谱中检测出m/z 237、193、165的碎片离子，保留时间分别25.66 min和26.83 min，裂解途径与升麻酸A、升麻酸B相似。结合文献[14]数据，2-阿魏酰基-番石榴酸的出峰时间早于2-异阿魏酰基-番石榴酸，推断化合物23可能为2-阿魏酰基-番石榴酸，化合物24可能为2-异阿魏酸酰基-番石榴酸。

图2 北升麻瑞、北升麻宁（A）、()-异落叶松脂素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（B）、咖啡酸（C）、阿魏酸（D）的裂解途径Fig. 2 Fragmentation pathways of cimidahurine and cimidahurinine (A),(+)-isolariciresinol-3-O-β-D-glucopyranoside (B),caffeic acid (C), and ferulic acid (D)

2.3.2 含氮化合物

图15所示为某型飞机叉耳式机身—机翼交点对接装配示意图，机身交点轴线faF的长度l1=800 mm，机翼交点轴线waF的长度l2=1 000 mm。基准A、基准B分别为机身、机翼的中心线。机身、机翼单独制造时，机身交点轴线faF相对基准A的同轴度要求faT=0.1 mm，机翼交点轴线waF相对基准B的同轴度要求waT=0.2 mm。机身—机翼对接装配时，waF相对faF的同轴度误为协调控制对象。利用交点轴线T-Maps和累积T-Map的几何关系进行公差累积分析，以获的空间波动域。

鉴定含氮化合物共6 个，其中生物碱类2 个，酰胺类4 个。分别为表2中的化合物1、10、16、18、19和25。

化合物1结合一个氢离子得到母离子m/z 154.097 1[M＋H]＋，其保留时间为1.11 min，二级质谱中测定出m/z 112、95的碎片离子，根据文献[13]以及碎片离子质量，推测其裂解途径为准分子离子失去一分子碳二亚胺（NH＝C＝NH），得到碎片m/z 112 [M＋H－42]＋，碎片m/z 112进一步丢失一分子H2O得到碎片m/z 95，其裂解途径如图3A所示，根据文献[13]数据推断化合物1可能为cimipronidine型生物碱cyclocimipronidine。

化合物25结合一个氢离子得到母离子m/z 614.367 1[M＋H]＋，其保留时间为30.45 min，检测到二级碎片离子为596，根据文献[23-24]以及依据氮规则推断出化合物为9,19-cycloane cycloartane型，含有一个氮原子，准分子离子失去一分子H2O得到碎片m/z 596 [M＋H－H2O]＋，此外，化合物还可与一个钠离子结合得到m/z 636 [M＋Na]＋。根据文献[23-24]数据推断化合物25可能为升麻碱。

化合物1 0结合一个氢离子得到母离子m/z 492.185 3 [M＋H]＋，其保留时间为13.87 min，检测到二级碎片离子m/z 330、177，根据文献[13]以及依据氮规则推断出化合物含有一个氮原子，推测其裂解过程为准分子离子丢失一分子糖基，得到碎片m/z 330 [M＋H－162]＋，R2位的糖基被H取代后，酰胺键断裂，生成阿魏酸碎片，得到m/z 177的碎片离子。与自制的升麻酰胺A标准品进行对照，确定化合物10为升麻酰胺A。

化合物1 6结合一个氢离子得到母离子m/z 476.190 3 [M＋H]＋，其保留时间为16.15 min，二级质谱中检测到m/z 314 [M＋H－162]＋、177的碎片离子，裂解途径与升麻酰胺A相似，与自制的反式阿魏酰酪胺-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷标准品进行对照，结合文献[13]数据确定化合物16为反式阿魏酰酪胺-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，其裂解途径如图3B所示。

图3 Cyclocimipronidine（A）、反式阿魏酰酪胺-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（B）、升麻酰胺（C）的裂解途径Fig. 3 Fragmentation pathways of cyclocimipronidine (A), transferuloyl tyramine-4-O-β-D-glucopyranoside (B), and cimicifugamide (C)

化合物18、19均结合一个氢离子得到母离子m/z 506.202 3 [M＋H]＋，二级碎片离子均为m/z 344 [M＋H－162]＋、177，保留时间分别为17.71 min和18.06 min，裂解途径与升麻酰胺A相似，两者质谱数据相同，互为同分异构体，推测两者的甲氧基与糖基的位置不同，根据文献[21-22]异升麻酰胺的出峰时间早于升麻酰胺，推断化合物18可能为异升麻酰胺，化合物19可能为升麻酰胺，其裂解途径如图3C所示。

2.3.3 色原酮类

图4 升麻素的裂解途径Fig. 4 Fragmentation pathways of cimifugin

2.3.4 皂苷类

鉴定皂苷类化合物共13 个。升麻属最主要的成分是三萜皂苷，大多为同分异构体。分别为表2中的化合物26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38。

化合物2 6结合一个氢离子得到母离子m/z 637.393 7 [M＋H]＋，其保留时间为40.58 min，检测到二级碎片离子m/z 487 [M＋H－150]＋，根据文献[25]以及碎片离子质量，推测准分子离子失去一分子木吡喃糖得到碎片m/z 487，推测化合物26可能为12-β-羟基升麻醇-3-O-α-L-阿拉伯糖苷。

化合物2 7失去一个氢离子得到母离子m/z 679.406 5 [M－H]－，其保留时间为40.61 min，二级质谱检测到碎片m/z 619，根据文献[26]及碎片离子质量，推测裂解途径为准分子离子失去乙酰氧基碎片，得到m/z 619 [M－H－59]－的碎片离子，推断出化合物27可能为hydroshengmanol型的24-O-乙酰氢化升麻新醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷。

化合物28、29均失去一个氢离子得到母离子m/z 661.39 [M＋H]＋，检测到二级碎片离子为m/z 643、601、583，保留时间分别为52.65 min和61.78 min，根据文献[26-27]及碎片离子质量，推测准分子离子失去一分子H2O和一分子乙酰氧基碎片，得到m/z 643[M＋H－18]＋、601 [M＋H－59]＋及m/z 583 [M＋H－18－59]＋的碎片离子，并且23-epi-26-脱氧升麻烃出峰时间早于26-脱氧升麻烃，结合文献数据推测化合物28可能为23-epi-26-脱氧升麻烃；化合物29可能为26-脱氧升麻烃，其裂解途径如图5A所示。

化合物31、32和33均失去一个氢离子得到母离子m/z 661.39 [M＋H]＋，二级离子碎片均为m/z 643、601、583，保留时间分别为66.99、67.11 min和78.39 min，裂解途径与23-epi-26-脱氧升麻烃、26-脱氧升麻烃相似。结合文献[25]与不同化合物的出峰时间对照，含阿拉伯糖苷的化合物出峰时间早于含木糖的化合物，推断化合物31可能为25-O-乙酰-7,8-双去氢升麻酮醇-3-O-α-L-阿拉伯糖苷；化合物32可能为25-O-乙酰-7,8-双去氢升麻酮醇-3-O-α-L-木糖苷；化合物33可能为3’-O-乙酰-24-epi-7,8-双去氢升麻酮醇-3-O-β-D-木糖苷。

化合物3 0结合一分子醋酸得到母离子m/z 665.389 1 [M＋HCOO]－，其保留时间为63.72 min，二级质谱中检测到碎片离子m/z 647、619 [M－H]－、533，根据文献[25]及碎片离子质量，推测化合物为cimigenol型皂苷，准分子离子失去一分子H2O，得到碎片m/z 647[M＋HCOO－H2O]－，或失去阿拉伯糖中性分子得到碎片m/z 533 [M＋HCOO－132]－，其裂解途径如图5B所示，推断化合物30可能为升麻酮醇-3-O-α-L-阿拉伯糖苷。

化合物34、35均结合一个氢离子得到母离子m/z 619.384 6 [M＋H]＋，二级碎片离子均为m/z 601、487，保留时间不同，分别为78.87 min和79.09 min，根据文献[26]及碎片离子质量，推测化合物均为cimigenol型皂苷，准分子离子失去一分子H2O，得到碎片m/z 601 [M＋H－H2O]＋，或失去木吡喃糖糖中性分子得到碎片m/z 487[M＋H－132]＋，7,8-双去氢升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷出峰时间早于24-epi-7,8-双去氢升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷，与自制24-epi-7,8-双去氢升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷标准品对照，确定化合物35为24-epi-7,8-双去氢升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷，结合文献[26]数据推断化合物34为7,8-双去氢升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷。

化合物3 6结合一个氢离子得到母离子m/z 621.397 9 [M＋H]＋，其保留时间为79.32 min，二级谱中碎片离子为 m/z 603、453，根据文献[28]以及碎片离子质量，推测化合物为cimigenol型皂苷，准分子离子失去一分子H2O得到碎片m/z 603 [M＋H－H2O]＋，碎片m/z 603继而失去木吡喃糖糖碎片得到m/z 453 [M＋H－H2O－150]＋，此外，化合物还可与一分子钠离子结合得到m/z 643 [M＋Na]＋。与升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷标准品对照，确定化合物36为升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷。

化合物3 7结合一个氢离子得到母离子m/z 663.410 1 [M＋H]＋，其保留时间为84.84 min，二级谱测得碎片离子m/z 645，根据文献[25]以及碎片离子质量，推测化合物为cimigenol型皂苷，准分子离子失去一分子H2O得到碎片m/z 645 [M＋H－H2O]＋，结合文献[25]数据推断化合物37可能为25-O-乙酰升麻酮醇-3-O-α-L-阿拉伯糖苷。

化合物3 8失去一个氢离子得到母离子m/z 619.383 5 [M－H]－，其保留时间为88.85 min，检测到二级碎片离子m/z 601，通过碎片m/z 601推测裂解途径为准分子离子失去一分子H2O，得到碎片m/z 601 [M－HH2O]－，此外，化合物还可与一分子醋酸离子形成加合离子m/z 665 [M＋HCOO]－。结合文献[25]数据，推断化合物38可能为升麻新醇木糖苷。

图5 26-脱氧升麻烃（A）和升麻酮醇-3-O-α-L-阿拉伯糖苷（B）的裂解途径Fig. 5 Fragmentation pathways of 26-deoxyactein (A), and cimigenol-3-O-α-L-arabinoside (B)

3 结 论

实验共鉴定了兴安升麻中的38 种化学成分，其中包括18 个苯丙素类化合物，6 个含氮化合物，13 个皂苷类化合物以及1 个色原酮。以上成分中，苯丙素类具有抗肿瘤、抗HIV、抗氧化、抗炎、抗微生物、抗凝血等方面的生物活性，某些苯丙素还有降血脂、降血压、降血糖、抗血栓、抗突变、抗早孕，抗毒蛇，镇痛镇静等作用[29]；生物碱类具有抗炎、抗菌、扩张血管、强心、平喘、抗癌等作用[30]；皂苷类具有调节免疫能力、护脑护心、延缓衰老、抗肿瘤、扩张脑血管、增加血流量、抑制中枢神经和中枢镇静的作用，还能补气生血[31]。兴安升麻可治疗围绝经期综合征，具有抗肿瘤、抗骨质疏松、抗炎、免疫抑制作用以及降糖作用等[32]，推测与上述成分的多种药理活性协同发挥作用有关。综上所述，本研究利用UPLC-Q-TOF-MS技术，对兴安升麻的甲醇提取物进行了多个成分的鉴定，可为后续进一步的化学物质基础及质量控制和临床应用提供一定的参考。