汾远2号远志的rDNA ITS等位基因特异性PCR鉴别研究

李 娟,王丹丹,孔冉冉,田洪岭,张福生,秦雪梅,马存根

(1山西药科职业技术学院药学系,太原 030031;2山西大学中医药现代研究中心;3石家庄四药有限公司;4山西大学化学化工学院;5山西省农业科学院经济作物研究所;6山西中医药大学;*通讯作者,E-mail:ample1007@163.com;#共同通讯作者,E-mail:macungen2001@163.com)

远志是我国重要的大宗中药材之一[1],中国药典规定为远志科植物远志(PolygalatenuifoliaWilld.)或卵叶远志(PolygalasibiricaL.)的干燥根,具有安神益智、交通心肾、祛痰消肿等功效,是临床益智类处方中使用频率名列前3位的单味中草药[2-5],其临床需求量正日益增大。目前,市场上常见的远志伪品有:白薇(CynanchumatratumBge.)、蔓生白薇(C.versicolorBge.)[6]、麦冬[Ophiopogonjaponicus(L.f)Ker-Gawl.][7]等,上述伪品给远志药材的质量稳定性与用药安全性造成了极大的隐患。晋远1号(简称JY1)是山西省农业科学院经济作物研究所(简称汾阳经作所)选育的我国第一个远志品种[8];而汾远2号(简称FY2)则是汾阳经作所选育出来的另一个远志新品种,并于2015年11月通过了田间认定。本课题组之前的研究曾发现JY1和FY2在化学物质基础上各具优势[9],上述远志新品种的成功选育,为今后扩大远志药材的用药资源奠定了坚实的基础。

rDNA中的ITS序列具有种内变异小而种间变异大的特点。近年来,ITS序列在药用植物的分子鉴定(种间、种内的真伪鉴别研究)、遗传多样性、亲缘关系鉴别等方面已有大量研究[10,11]。樊杰等[12]利用ITS 1和ITS 2序列鉴别出远志属7种药用植物,马孝熙等[13]利用psbA-trnH序列对中药材远志及其混伪品进行了分子鉴定,而依据rDNA ITS序列碱基差异位点设计特异性PCR鉴别引物,用于远志种间尤其是远志种内的研究则尚未见报道。本研究通过测定rDNA ITS序列,针对FY2的rDNA ITS序列碱基差异位点,设计特异性PCR鉴别引物,从而实现FY2的分子鉴别。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 植物材料 本次实验用到的卵叶远志(P.sibirica),采自于陕西省宝鸡市太白县桃川镇(野生);而远志(P.tenuifolia)样本则均来源于山西省,分为:同一产地(汾阳经作所,栽培,不同农艺性状,No.2-No.21)和不同产地(栽培和野生,No.22-No.29)的两类样本。样品信息见表1。样品经山西大学中医药现代研究中心张福生副教授鉴定为正品,并存放于山西大学标本室。

1.1.2 仪器与试剂 基因扩增仪(TC-XP-D,杭州博日科技有限公司),稳压稳流电泳仪(DYY-6B,北京市六一仪器厂),全自动凝胶成像分析系统(ZF-258,上海嘉鹏科技有限公司),高速台式冷冻离心机(TGL-16,湘仪离心机),移液器(Eppendorf)。

Biowest琼脂糖,β-巯基乙醇均购于太原灏洋生物科技有限公司;GoldView I型核酸染色剂,北京索莱宝科技有限公司;DL 2000 DNA Marker,日本TaKaRa公司;CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号:DN14,50次),北京艾德莱生物科技有限公司;基因组DNA扩增反应液(2×EasyTaqPCR SuperMix),北京全式金生物技术有限公司;三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇等试剂,国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR扩增和ITS测序 用十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)植物基因组DNA快速提取试剂盒提取所有样本的DNA,并用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量。以JY1和FY2的DNA为模板,通用型引物(5F:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′;4R:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)作为PCR引物,进行PCR扩增反应。PCR反应体系为25 μl,含有:3 μl模板DNA;引物5F与4R,各1 μl;12.5 μl 2×EasyTaqPCR SuperMix;7.5 μl ddH2O。PCR反应程序为:93 ℃ 5 min;93 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环;72 ℃ 5 min,10 ℃ 10 min。PCR产物采用1.2%的琼脂糖凝胶进行检测。如果在600 bp左右出现一条明亮的条带,则说明PCR反应成功,并将PCR产物送至上海桑尼生物科技有限公司测序。为保证序列的可靠性及真实性,所有PCR扩增产物均进行双向测序。

表1 远志样品信息表

Table 1 Samples information of Polygalae Radix

编号样品 采集地 生长方式1卵叶远志 P. sibirica L.陕西省宝鸡市太白县桃川镇野生2远志 P. tenuifolia(JY1)汾阳经作所栽培3远志 P. tenuifolia(FY2)汾阳经作所栽培4远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培5远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培6远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培7远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培8远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培9远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培10远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培11远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培12远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培13远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培14远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培15远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培16远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培17远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培18远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培19远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培20远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培21远志 P. tenuifolia汾阳经作所栽培22远志 P. tenuifolia山西省临汾市襄汾县南贾镇南贾村栽培23远志 P. tenuifolia山西省吕梁市石楼县小蒜村野生24远志 P. tenuifolia山西省运城市闻喜县凹底镇辛村栽培25远志 P. tenuifolia山西省运城市夏县庙前镇中条山产地栽培26远志 P. tenuifolia山西省忻州市定襄县受禄乡上零山村野生27远志 P. tenuifolia山西省忻州市河曲县巡镇野生28远志 P. tenuifolia山西省忻州市静乐县城朝阳山野生29远志 P. tenuifolia山西省阳泉市盂县西潘乡郑沟村野生

1.2.2 测序结果分析与特异性引物设计 测序所得序列,用生物学软件DNAStar version 4.0校对拼接,去除低质量序列及引物区。测序所得的序列采用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站在线BLAST程序进行序列同源性检索,结果表明JY1、FY2与NCBI中远志的相似度最高(相似度达99.36%),证实测序结果具有很好的可靠性。利用DNAMAN对比上述所有样品的序列,找出FY2所不同于其他远志序列的差异位点,并用FY2的序列和NCBI中已有的远志序列(NCBI登录号分别为:KM051449.1、AB507258.1、DQ267099.1)和作者测序得到的卵叶远志的序列(NCBI登记号为:1885126)进行比对,验证差异位点的正确性。FY2和JY1、卵叶远志以及NCBI网上远志序列的比对结果见图1。FY2在第123位点为T,其余样品均为A,第553位点为T,其余样品均为C,共有两个差异位点。根据FY2差异位点的位置,利用生物学软件Primer premier 5.0分别在ITS序列的上、下游各设计约20个碱基的引物[14-15],最终确定FY2的4对特异性PCR引物,见表2。

1.2.3 特异性PCR引物鉴别 以不同的远志样本DNA为模板进行PCR扩增,PCR扩增体系与1.2.1的PCR扩增体系相同,1-3号引物的PCR扩增条件与1.2.1项下的PCR扩增条件相同,4号引物的退火温度为65 ℃,其余条件均同于1.2.1项下的PCR扩增条件。PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳,在凝胶成像系统中进行观察,并照相保存。为了检测特异性PCR引物鉴定方法的适用性和灵敏度,将远志基因组DNA模板分别进行等量混合和梯度稀释后,按照上述方法进行PCR扩增。

图1 FY2与JY1、卵叶远志以及NCBI网上序列的比对结果Figure 1 The sequence comparison result of the FY2, JY1, P. sibirica and NCBI

表2 FY2的特异性PCR引物

Table 2 Allele-specific identified primer pairs for FY2

引物编号引物序列(5′-3′) 退火温度(℃)1F1:CGACCGTTGGACACGTATTR1:TCGCCCCAAGAGATGTGA602F2:CGACCGTTGGACACGTATTR2:TCGCCCCAAGAGATCAGA603F3:CGACCGTTGGACACGAATTR3:TCGCCCCAAGAGATGTGA604F4:CGACCGTTGGACACGTATTR4:TCGCCCCAAGAGATGAGA65

2 结果

2.1 特异性PCR引物的适用性考察

2.1.1 特异性PCR引物的种间适用性考察 以卵叶远志P.sibirica作为DNA模板,用4对引物分别扩增卵叶远志;并以1号引物对为例,设置阴性对照组,分别验证4对引物的特异性,其结果见图2。4对引物不能扩增出卵叶远志,说明这4对引物能够鉴别出卵叶远志,具有种间特异性;阴性对照组中没有加入DNA模板,所以没有任何条带出现。

2.1.2 特异性PCR引物的种内适用性考察 经研究表明,地理位置相近的远志资源相似性系数较高,亲缘关系较近[16],为验证上述4对引物的广泛适用性,首先取采自于汾阳经作所的JY1和FY2的DNA,运用表2中的4对特异性引物分别对相应模板DNA进行扩增。图3结果显示,4对特异性引物只能扩增FY2,不能扩增JY1,表明4对特异性引物只对FY2适用,专属性较好。

1-4.4对引物分别扩增卵叶远志;K.阴性对照;M.DL 2000 DNA Marker图2 特异性引物对卵叶远志的PCR扩增结果Figure 2 PCR amplification results of specific primers on P. sibirica

1,3,5,7.DNA模板为JY1;2,4,6,8.DNA模板为FY2;1,2.扩增引物为引物对1;3,4.扩增引物为引物对2;5,6.扩增引物为引物对3;7,8.扩增引物为引物对4;M.DL 2000 DNA Marker图3 特异性引物对JY1和FY2的PCR扩增结果Figure 3 PCR amplification results of specific primers on JY1 and FY2

将表1中远志基因组DNA等量混匀后进行PCR,结果见图4。图3B中1-4泳道中没有FY2的基因组DNA,结果没有扩增条带出现;而图4A中的DNA模板为含有FY2 DNA的等量混合物,结果显示,PCR产物在463 bp处有单一的条带,FY2在多种远志的混合材料中被很好地鉴别出来。经过重复验证,结果保持稳定。

2.2 特异性引物的灵敏度考察

检测FY2的DNA浓度为11.8 ng/μl。将上述DNA样品进行梯度稀释,稀释后的浓度分别为1.18,0.236,0.118,0.023 6,0.011 8 ng/μl,于-20 ℃保存备用。

1-4.4对引物分别扩增含有FY2 DNA的等量混合样品;5-8.4对引物分别扩增没有FY2 DNA的等量混合样品;M.DL 2000 DNA Marker图4 特异性引物对混合样品的PCR扩增结果Figure 4 PCR amplification results of specific primers on mixed samples

分别以上述稀释的DNA样品为模板,用1-4号引物对进行PCR扩增反应。PCR扩增体系、PCR扩增程序和扩增产物检测方法同上,结果见图5。当FY2的DNA模板浓度稀释至0.011 8 ng/μl时,即用量为0.059 ng时,1号引物对在约463 bp处依然出现FY2的特异性条带。因此,1号引物对的检测灵敏度可达0.011 8 ng/μl,可见,本方法的检测灵敏度高,可检测出样品中约0.059 ng的FY2。同理,2号引物对可检测出样品中约0.118 ng的FY2;3号引物对可检测出样品中约0.118 ng的FY2;4号引物对可检测出样品中约0.059 ng的FY2。经过多次重复验证,结果保持稳定。

1-5.DNA浓度分别为1.18,0.236,0.118,0.023 6,0.011 8 ng/μl,引物为1号引物;M.DL 2000 DNA Marker;6-10.DNA浓度分别为1.18,0.236,0.118,0.023 6,0.011 8 ng/μl,引物为2号引物;11-15.DNA浓度分别为1.18,0.236,0.118,0.023 6,0.011 8 ng/μl,引物为3号引物;16-20.DNA浓度分别为1.18,0.236,0.118,0.023 6,0.011 8 ng/μl,引物为4号引物图5 特异性引物对不同DNA浓度FY2的PCR扩增结果Figure 5 PCR amplification results of specific primers on different concentrations of DNA of FY2

3 讨论

有学者曾针对远志药材的基原进行过深入研究,传统的鉴定方法包括:基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定以及理化鉴定等[6,7],现代的鉴定方法则包括:薄层色谱法[17]、紫外光谱法[17]、HPLC指纹图谱法[18]、DNA条形码鉴定[12,13]等。中药鉴定技术贯穿于中药材种植、加工、生产等各个环节,随着中药产业的发展,传统鉴定方法已经难以满足医院、药店、企业、海关等各行业快速、标准的鉴定需求,因此需要建立新的鉴定方法。陈士林等[19,20]提出建立以ITS2为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系。然而由于DNA测序技术复杂、成本高,目前在全国推广应用还有一定的局限性。

本文的研究目的是在无需对PCR扩增产物测序的情况下,利用特异性PCR引物,快速、准确地从未知远志样品中鉴别出FY2,为FY2的分子鉴定提供依据。通过对远志rDNA ITS序列进行分析,寻找FY2的rDNA ITS序列碱基差异位点,并在此基础上设计出4对特异性PCR鉴别引物,上述特异性引物能以FY2为模板DNA扩增出一条约463 bp左右的DNA片段。该特异性PCR引物鉴别方法具有成本小、用时短、效率高、操作简便、特异性好、灵敏度高、无需测序等优点,只需通过简单的PCR反应就可以有效地将FY2从其他远志中鉴别出来。这种方法具有准确、高效的优点,并且对操作人员的技术要求比较低,兼具灵敏度和适用性,可以制备成试剂盒推广应用,服务于我国各级药监部门的日常检查及抽查工作,具有广阔的应用前景。

JY1和FY2都是汾阳经作所选育出来的新品种,这4对特异性引物为远志新品种的推广提供了分子鉴别的便利。特异性引物的种内适用性考察和灵敏度考察结果分别显示:这4对特异性引物不仅可以检测单个FY2样品,还可以在混合物中检测出FY2,适用范围较广;4对引物特异性PCR鉴定方法的灵敏度很高,含量极微弱的FY2也能够被鉴定出来。

由于本文只考察了山西产(不同地区和不同生长方式)的远志和陕西产野生卵叶远志,未对其余产地的远志进行考察,因此后续有待引入更多的远志品种及样品进行引物的适用性考察。