小鼠Cdc25B基因的真核表达载体构建及鉴定

周晓敏,孟 峻,刘岚清

(1内蒙古医科大学附属医院临床检验诊断学教研室,呼和浩特 010059;2内蒙古医科大学附属医院检验科;*通讯作者,E-mail:nmfrank@163.com)

细胞分裂周期25(cell division cycle 25,Cdc25)蛋白家族是一种双重特异性磷酸酶,参与细胞周期的调控,是有丝分裂过程中最主要的启动者[1]。Cdc25家族包含三种磷酸酶,分别是Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C,它们的长度在470-566个氨基酸之间,这些基因的同源基因首次在鸡中被发现[2]。本文通过构建小鼠Cdc25B基因真核表达载体,为Cdc25B与Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换作用的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

目的基因、细胞株、菌种和质粒:目的基因Cdc25B由鸿讯生物科技有限公司化学合成;真核表达载体pcDNA3.1(+)和DH5ɑ感受态大肠杆菌由广州辉骏生物科技有限公司提供;HEK293细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 试剂与仪器

DMEM培养基(GIBOC公司产品);微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海生工B518131-0100);限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ和ApaⅠ(Thermo Scientific);质粒小提试剂盒(生工B518191-0050);ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit连接酶(诺唯赞C112-2);上海生工公司完成DNA测序。低温超速离心机(美国,Sigma公司);基因扩增仪(HEMA,9600);紫外分光光度仪(北京思博全公司);洁净工作台(AIRTECH,SW-OJ-2F);CO2培养箱CB115(WTB-binder,德国);恒温空气振荡器(上海艾测电子科技有限公司);台式高速离心机(TG17-WS,上海卢湘仪器有限公司);凝胶自动成像仪GDS9000(美国,Bio-Rad公司);电泳仪(君意,JY600E)。

1.3 实验方法

1.3.1 目的基因的获取 带有3xflag标签的Cdc25B目的基因由鸿讯生物科技有限公司化学合成。

1.3.2 载体双酶切:使用无菌的0.2 ml EP反应管,取5 μg的pcDNA3.1(+)载体,10×Buffer 5 μl;pcDNA3.1(+) 5 μg;KpnⅠ 1.5 μl;XhoⅠ 1.5 μl;加入无酶水使总体积到50 μl,37 ℃,酶切反应20 min;取酶切产物6 μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

酶切产物的回收:电泳30 min后,紫外灯照射下,用手术刀将琼脂糖凝胶上线性化的载体条带小心地切割出来,放置于无菌无酶的1.5 ml EP管中,用(来自上海生工)微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA目的片段(实验详细步骤见试剂盒说明书)。

1.3.3 目的片段与载体连接 连接目的片段3xflag-Cdc25B与线性化载体,反应体系为:3xflag-Cdc25B 100 ng;pcDNA3.1(+) 100 ng;5x CE Ⅱ Buffer 4 μl;ClonExpress Ⅱ One Step CloningKit连接酶2 μl;加无酶水补充到总体积20 μl;37 ℃连接30 min,冰浴5 min。

1.3.4 连接产物转化感受态细胞 100 μl DH5ɑ感受态细胞置于冰水中解冻,加入2 μl连接产物,缓慢摇匀,冰浴30 min后于42 ℃水浴中热休克45 s,立即放在冰中,冰浴2 min。然后加入500 μl LB培养基,于37 ℃、225 r/min振荡培箱中培养1 h后,取50,100,150 μl 3个递增梯度的量的菌液均匀涂布于3个含Amp抗生素(100 μg/ml)的琼脂平板上。倒置放于37 ℃孵育箱中过夜培养。挑取单个菌落于Amp+LB(100 μg/ml)培养基3管(每管约5 ml)中培养12-16 h,测定其OD值约为2-3时提取质粒。

1.3.5 用质粒小提试剂盒提取质粒 取细菌培养液5 ml于干净无菌的离心管中,8 000 r/min离心2 min,吸干培养基;加入250 μl Buffer P1/RNase A混合液,使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀;加入250 μl Buffer P2,立即平和颠倒混匀离心管5-10次,室温静置2-4 min;加入350 μl Buffer P3,出现白色沉淀,立即平和颠倒离心管5-10次混匀,12 000 r/min离心12 min,将上清全部移入吸附柱,8 000 r/min离心30 s,倒掉收集管中的液体;在吸附柱中加入500 μl Buffer DW1,8 000 r/min离心30 s,倒掉收集管中的液体;在吸附柱中加入500 μl Wash Solution,8 000 r/min离心30 s,倒掉收集管中的液体;再用500 μl Wash Solution洗一次,8 000 r/min离心30 s,倒掉收集管中的液体。离心空吸附柱,8 000 r/min离心1 min;将吸附柱放入新的1.5 ml离心管中,在吸附膜中央加入65 μl已经预热到65 ℃的Elution buffer,为提高洗脱率,室温静置2 min,8 000 r/min离心1 min,将所得质粒DNA溶液置于-20 ℃保存,用于后续的体外转录实验。

1.3.6 质粒酶切鉴定 用限制性内切酶KpnⅠ和ApaⅠ进行双酶切,酶切反应体系为:10×Buffer 5 μl;pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B 2 μg;限制性内切酶KpnⅠ和ApaⅠ各1 μl;加无酶水补充到总体积20 μl;37 ℃酶切20 min。酶切完成后,取6 μl 15 000 Marker和6 μl酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳鉴定完毕后,送上海生工进行质粒DNA序列测定,进一步证明pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B真核表达载体构建成功。

1.3.7 细胞培养和转染 HEK293细胞在DMEM培养液(含10 μg/ml链霉素,10%胎牛血清,100 U/ml青霉素)中37 ℃ 5%CO2培养至细胞密度达到80%后用LipofectamineTM2000试剂盒转染HEK293细胞,具体步骤参考试剂盒说明书。24 h后,细胞可转染5 μg pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B DNA。

1.3.8 Western blot检测pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B的表达 转染细胞48 h后收集目的细胞并提取蛋白,用BCA试剂盒检测其浓度。按比例将上样缓冲液加入50-80 μg的蛋白样品,沸水浴10 min,冷却离心后在12%的分离胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),湿转法在110 V 90 min电转至PVDF膜。用磷酸盐缓冲液和TBST溶解的5%的脱脂奶粉室温封闭1 h,孵育一抗[兔来源的抗CDC25B单克隆抗体(1 ∶200),兔来源的抗β-actin单克隆抗体(1 ∶1 000)]4 ℃过夜,次日用TBST洗涤4遍(每次8 min),然后室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(鼠抗兔的单抗IgG 1 ∶5 000)2 h,最后用ECL来检测在PVDF膜上的蛋白表达情况。

2 结果

2.1 真核表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B的构建及鉴定

3xflag-Cdc25B目的片段与pcDNA3.1(+)载体连接,经测序公司进行质粒DNA序列测定分析,目的基因插入正确,测序结果见图1。取构建成功的真核表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B,用限制性内切酶KpnⅠ和ApaⅠ进行双酶切鉴定,结果见图2。电泳结果显示,目的基因3xflag-Cdc25B条带对应约1 700 bp、载体条带pcDNA3.1对应约5 300 bp,与预期片段大小相符,进一步证明插入基因正确,获得pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B真核表达载体,可用于体外转录。

图1 pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B测序结果Figure 1 Sequencing result of pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B

2.2 真核表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B在HEK293细胞中的表达

通过脂质体介导的基因转染方法将构建的载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B转染HEK293细胞,用anti-β-actin抗体作为内参和anti-3xflag标签抗体进行Western blot检测,结果显示,在转染了真核表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B的HEK293细胞内,3xflag-Cdc25B有表达(见图3)。真核表达载体pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B构建成功并能正确表达Cdc25B。

1. pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B质粒DNA双酶切(KpnⅠ和ApaⅠ)产物;M. DL15000 DNA marker图2 pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B质粒DNA双酶切结果Figure 2 Double enzymatic digestion of pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B DNA

1.未转染组;2.空载体组;3.转染3xflag-Cdc25B组图3 3xflag-Cdc25B在HEK293细胞中的表达Figure 3 Expression of 3xflag-Cdc25B in HEK293 cells

3 讨论

细胞分裂周期25(CDC25)磷酸酶是真核细胞周期调控的关键因子,负责在细胞周期的特定阶段激活细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的去磷酸化作用[3]。人类CDC25A,CDC25B和CDC25C也是针对DNA损伤激活的G2/M检查点机制的中心靶点和调控因子[4]。这些激酶的活性与表达受多种机制调控包括翻译后修饰,可通过与其他调控分子间的相互作用,调控细胞的定位,调控细胞周期降解等[5]。Cdc25B通过脱磷酸Cdc2(Cdk1)的Thr14和Tyr15来激活cyclin B1-cdc2复合体(MPF),导致G2/M期转变[6]。并且有研究[7]证明,利用基因敲除技术沉默小鼠Cdc25B基因,可导致卵母细胞发生减数分裂阻滞;而显微注射Cdc25B mRNA却可以提高受精卵的卵裂率。这些试验证明了Cdc25B对于小鼠卵母细胞和受精卵的发育是必需的[8]。

迄今为止,关于小鼠Cdc25B真核表达载体的构建和Cdc25B与Cdc14A在小鼠卵母细胞和受精卵发育中作用和机制的相关研究在我国少见。本实验化学合成带有3xFlag标签的目的基因Cdc25B,成功构建了pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B真核表达载体。利用细胞转染将pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B载体转染HEK293细胞后,用Western blot证实转染细胞内的Cdc25B成功表达,为进一步研究Cdc25B与Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换中的相互作用奠定了扎实的基础。