异丙酚对急性脊髓损伤大鼠神经元凋亡的影响

郝建红,何 非,吴赞情,罗振国,董补怀

(西安交通大学医学院附属红会医院麻醉科,西安 710000;*通讯作者,E-mail:dongbuhai@sina.com)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是指脊髓受到损害,并使其功能(感觉、运动及反射等)出现障碍的一类严重损伤。脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤,急性脊髓损伤后,神经细胞凋亡是继发性损伤的重要组成部分[1,2]。细胞凋亡途径包括Caspase依赖性凋亡途径和AIF介导的Caspase非依赖性凋亡途径。脊髓损伤患者大多需要手术治疗,必然涉及麻醉用药。异丙酚是一种静脉麻醉药,该药物具有起效快、诱导平稳、苏醒快等优点,广泛应用于外科手术病人的麻醉和重症监护室病人的镇静。目前研究证明异丙酚具有抗凋亡作用[3-8]。鉴于细胞凋亡在脊髓损伤中的重要作用和异丙酚的抗凋亡作用,我们把注意力转移到异丙酚抗凋亡在脊髓损伤中的神经保护作用。本研究采用Allen’s致伤法建立大鼠脊髓损伤模型,观察异丙酚对脊髓损伤后凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)和Caspase-3蛋白的表达及细胞凋亡的影响,进一步探讨异丙酚抑制急性脊髓损伤大鼠神经元凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 选取72只Wistar大鼠,体质量200-250 g,雄性,清洁级,购自我院动物实验中心,随机分为3组:假手术组、SCI组和异丙酚组,每组24只大鼠。假手术组大鼠仅接受手术而不遭受脊髓打击;SCI组和异丙酚组采用改良的Allen’s致伤方法建立大鼠急性脊髓损伤模型。异丙酚组的大鼠在脊髓损伤后4 h,经股静脉持续泵注异丙酚1.0 mg/(kg·min),持续1 h。

1.1.2 主要药物 异丙酚(批号为0912211 XLH 09,四川国瑞药业有限责任公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠急性脊髓损伤动物模型的建立 采用改良的Allen’s致伤方法建立大鼠急性脊髓损伤模型[9]。所有实验动物术前12 h禁食、4 h禁水,应用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠,脊柱后正中线做手术切口,长约2 cm,切开皮下筋膜组织,钝性游离肌肉,椎板切除术,暴露T11胸髓,致伤重物锤设置25 gcf(冲击量为10 g重物从2.5 cm高处自由落下,gram cm force),重物锤底部直径为1.5 mm,造成大鼠中度脊髓损伤,撞击后,迅速移开重物锤,脊髓和皮肤伤口表面抗生素处理,肌肉、筋膜、皮肤由内向外逐层缝合。假手术组只切除椎板不做脊髓撞击损伤处理,之后逐层缝合伤口。大鼠造模成功标准:脊髓撞击处出现充血水肿,撞击瞬间可有鼠尾迅速来回摆动、后肢扑动,明显的下肢软瘫,大鼠清醒后出现双后肢运动功能障碍。术后预防感染,大鼠每天皮下注射庆大霉素(12 mg/kg),单笼饲养,每日更换垫料,术后第一周实行每日早晚两次膀胱按摩,直至大鼠可以自主排尿。

1.2.2 HE染色病理形态学观察 各组分别于术后1,3,5,7 d将大鼠在麻醉(氟烷)状态下开胸,暴露心脏,用10%多聚甲醛固定液灌注。先灌注50 ml,之后用微量静脉输液泵滴注100 ml固定液。解剖椎管,以伤处为中心取1.5 cm脊髓组织进行外固定。经过常规的70%-100%的乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡浸透包埋后,做连续切片,切片厚度约为5 μm,贴在多聚赖氨酸防脱片剂处理过的载玻片上,以备HE染色和免疫组织化学使用。切片常规脱蜡至水,苏木素-伊红染色。在光镜下观察脊髓神经元病理形态学改变。

1.2.3 TUNEL法测定脊髓损伤后神经元凋亡 按照POD试剂盒(上海索宝生物科技有限公司,产品编号:1168481791)内说明书进行。光镜下,细胞核呈棕黄色或褐色为阳性染色,反应沉淀物分布在核周或浓缩成团。于凋亡阳性细胞分布区随机选择5个不重复高倍镜视野(10×40),以每个视野内的阳性细胞数作为凋亡的量化指标,计算凋亡阳性细胞百分比。阳性率=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%。

1.2.4 免疫组织化学检测脊髓Caspase-3、AIF的表达 在每只大鼠中随机图像选取6张脊髓切片做免疫组化染色(SP法),操作依据试剂盒说明书进行。兔抗大鼠多克隆抗体按1 ∶100稀释;PBS代替一抗作阴性对照。光镜观察脊髓组织变化,以细胞浆和/或核棕黄色着色为阳性细胞,分别计数每个视野的阳性细胞数。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 HE染色结果

光镜下观察可见假手术组神经元形态规则,白质致密。SCI组和异丙酚组1-3 d脊髓破坏,白质松散不规则,炎性细胞浸润,5-7 d损伤区域未见明显改变,大量炎性细胞浸润。异丙酚组损伤改变相对SCI组较轻(见图1)。

2.2 TUNEL染色结果

凋亡细胞呈棕褐色和棕黄色,胞核固缩颗粒深染,形态不规则,为散在和弥散性分布于损伤区域周围。假手术组未见凋亡细胞。SCI组和异丙酚组见凋亡细胞,3 d达高峰,异丙酚组各时点较SCI组细胞凋亡率明显减低,差异有统计学意义(P<0.05,见图2、表1)。

2.3 凋亡相关蛋白的测定

Caspase-3阳性细胞棕黄色,为胞浆和(或)胞核着色,散在和弥散性分布在损伤区域及周围。假手术组Caspase-3阳性细胞少见,SCI组和异丙酚出现阳性细胞(见图3)。Caspase-3阳性细胞3 d达高峰,异丙酚组各时点较SCI组Caspase-3阳性细胞表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

A.假手术3 d组;B.SCI 3 d组;C.异丙酚3 d组;D.SCI 7 d组;E.异丙酚7 d组图1 三组大鼠术后不同时间点的脊髓组织病理学改变 (HE染色,×400)Figure 1 The pathological changes of spinal cord tissue in three groups at various time (HE,×400)

A.假手术组 B.SCI组 C.异丙酚组图2 三组大鼠术后3 d TUNEL法测定脊髓神经元凋亡 (免疫组化,×400)Figure 2 The level of apoptosis of neural cell by TUNEL 3 d after operation in three groups (immunochemistry,×400)

表1 三组脊髓组织中TUNEL标记的阳性细胞

Table 1 TUNEL positive cells in spinal cord tissue in three groups

组别1 d3 d 5 d 7 d假手术组0.88±0.640.92±0.71 0.89±0.59 0.83±0.55SCI组35.20±6.08∗66.65±6.30∗52.72±10.66∗ 45.33±11.06∗异丙酚组28.45±7.32∗#38.21±5.23∗#33.65±7.33∗# 28.55±5.89∗#

与假手术组比较,*P<0.01;与SCI组比较,#P<0.05

A.假手术组 B.SCI组 C.异丙酚组图3 三组大鼠术后3 d脊髓Caspase-3表达 (免疫组化,×400)Figure 3 The expression of Caspase-3 by immunohistochemical staining 3 d after operation in three groups (immunochemistry,×400)

表2 三组脊髓组织中Caspase-3的表达

Table 2 Caspase-3 expression in spinal cord tissue in three groups

组别1 d3 d5 d7 d假手术组0.88±1.130.90±1.990.88±1.020.89±1.21SCI组26.40±6.75∗63.35±9.05∗36.78±5.64∗26.48±7.54∗异丙酚组23.72±5.51∗#37.66±6.17∗#20.11±5.31∗#18.73±4.87∗#

与假手术组比较,*P<0.01;与SCI组比较,#P<0.05

AIF阳性细胞棕黄色,为胞浆和(或)胞核着色。假手术组AIF阳性细胞少见,SCI组和异丙酚组出现阳性细胞(见图4)。AIF阳性细胞1 d达高峰,异丙酚组在1,3,5 d时较SCI组AIF阳性细胞表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。

A.假手术组 B.SCI组 C.异丙酚组图4 三组大鼠术后1 d脊髓AIF表达 (免疫组化,×400)Figure 4 The expression of AIF by immunohistochemical staining 1 d after operation in three groups (immunochemistry,×400)

表3 三组脊髓组织中AIF的表达

Table 3 AIF expression in spinal cord tissue in three groups

组别1 d3 d5 d7 d假手术组0.77±0.700.82±0.690.80±0.740.75±0.66SCI组11.07±1.97∗7.43±1.56∗4.23±1.02∗2.07±0.99∗异丙酚组5.11±1.07∗#4.72±1.17∗#2.71±0.94∗#1.98±1.04∗

与假手术组比较,*P<0.01;与SCI组比较,#P<0.05

3 讨论

1911年,Allen提出脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤为脊髓在创伤最初,由于受到外力而引起脊髓形态的变化以及传递的能量造成的损害,决定了受损的程度。继发性损伤是由原发性损伤所引起的细胞和生化环境的改变,从而导致持续性的细胞损害、死亡。

急性脊髓损伤后,神经细胞凋亡是继发性损伤的重要组成部分。细胞凋亡(apoptosis)是细胞在诱导因子作用下,启动自身基因的调控机制而发生的一种自主性、程序性细胞死亡过程。急性脊髓损伤后神经细胞凋亡在损伤后几小时、几天以至更长时间内发生，这由多种因素诱导,这些因素包括:缺氧、Ca2+内流增加、氧自由基损伤、神经营养因子减少以及促凋亡基因的表达等。细胞凋亡多发生于机械损伤部位周围,使脊髓损伤灶范围增加。

目前研究认为,细胞凋亡主要通路分别为死亡受体介导的凋亡途径(外源性途径)和线粒体凋亡途径(内源性途径)[10]。Caspase-3是凋亡过程中最重要的蛋白酶,在介导细胞凋亡过程中起重要作用。Caspase-3既参与凋亡启动,又参与凋亡程序执行,尤其是在凋亡执行阶段,负责对全部或部分关键蛋白进行剪切(激活或灭活),通过对蛋白激酶、核酸酶及细胞骨架的裂解,Caspase-3可激活特定信号系统,产生核皱缩、DNA片段形成等凋亡现象[11]。死亡受体介导的凋亡途径中,死亡受体通过与配体的连接(如Fas/Fas L、TRAILR/TRAIL、TNFR/TNFα之间的交叉反应)引起受体三聚化,进一步通过衔接分子与死亡位点结合后连接到胞质的受体上,反过来激活Caspase-8以及Caspase-3/7,诱发凋亡反应[12,13]。线粒体凋亡途径中,凋亡因子促使线粒体释放细胞色素C,细胞色素C经由三磷酸腺苷(ATP)使凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)发生构象改变而活化,从而使Caspase-9前体活化,活化的Caspase-9激活下游效应酶Caspase-3,切割特定的凋亡底物[14]。研究表明,脊髓损伤中存在着Caspase-3的表达上调,并且Caspase-3抑制剂可减少脊髓损伤后细胞凋亡[15,16],说明Caspase-3介导了脊髓损伤后神经细胞的凋亡(Caspase依赖性凋亡途径)。

近年来研究证实,在线粒体中还存在一些凋亡蛋白,如AIF等,进入胞质后能直接作用于细胞核,引发细胞凋亡。AIF介导的细胞凋亡是不依赖于Caspase信号级联的(Caspase非依赖性凋亡途径)[17]:AIF在线粒体内经过钙蛋白酶剪切后,具有诱导凋亡的活性,并从线粒体内释放出来,进入细胞核,对DNA进行剪切,直接引起核凝聚[18]。关于AIF介导的Caspase非依赖性凋亡途径是否参与脊髓损伤后细胞凋亡,研究甚少。本研究采用改良的Allen’s致伤法建立可靠的大鼠SCI模型,实验结果显示,大鼠脊髓损伤后出现细胞凋亡,Caspase-3,AIF表达增加,说明大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3介导的Caspase依赖性凋亡途径和AIF介导的Caspase非依赖性凋亡途径均参与了细胞凋亡的调节。

急性脊髓损伤后常需要实施外科手术,必然涉及麻醉用药。异丙酚是一种静脉麻醉药,该药物具有起效快、诱导平稳、苏醒快等优点,广泛应用于外科手术病人的麻醉和重症监护室病人的镇静。目前研究证明异丙酚具有抑制细胞凋亡作用[3-8]。鉴于细胞凋亡在脊髓损伤中的重要作用和异丙酚的抗凋亡作用,本研究将注意力转移到异丙酚抗凋亡在脊髓损伤中的神经保护作用。

异丙酚可以通过抑制凋亡相关途径抑制脊髓损伤神经元凋亡,但相关研究大多集中在异丙酚对Caspase依赖途径神经元凋亡的影响[3-8]。异丙酚是否通过调控AIF介导Caspase非依赖性凋亡途径信号通路抑制脊髓损伤神经元凋亡,类似于本研究的项目还未涉及。

凋亡诱导因子(AIF)是位于线粒体膜间隙的一种黄素蛋白,自从它在1996年被发现以来,就逐渐渗透到了胚胎发育、肿瘤研究、心脑疾病等多方面的研究[19,20]。编码它的基因包含16个外显子,坐落于X染色体Xq25-26(人类)片段和A6(小鼠)片段。AIF由3个明显的结构域组成:N末端约长100个氨基酸的线粒体定位序列(MLS),C末端约由485个氨基酸组成的氧化还原酶结构域,即FAD和NADH结合区,中间为由27个氨基酸组成的spacer区。前体AIF(62 kD)在胞浆中合成,然后被运送到线粒体膜上,其MLS会被切除,形成成熟的具有氧化还原酶活性的AIF(62 kD)。在生理情况下,AIF位于线粒体膜间隙,组成和维持线粒体氧化磷酸化和呼吸链循环,具有NADH氧化还原酶和过氧化物清除活性,维持细胞的存活、增殖及保障线粒体的完整性。当细胞受到特定的凋亡诱导信号的刺激后,62 kD的AIF在线粒体内被切割,变为成熟的57 kD的具有凋亡活性的AIF,线粒体膜上的通透性孔道MPTP打开,AIF被释放到胞浆中,并转位到核内进而引起DNA的大片段裂解(AIF线粒体核转位)[21,22]。本研究结果显示,大鼠脊髓损伤泵注异丙酚后脊髓组织细胞凋亡减少,Caspase-3和AIF表达下降,说明异丙酚对Caspase-3介导的Caspase依赖性凋亡途径和AIF介导的Caspase非依赖性凋亡途径均有调节作用,异丙酚通过抑制Caspase-3和AIF表达,减少脊髓组织细胞凋亡。

综上所述,大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3介导的Caspase依赖性凋亡途径和AIF介导的Caspase非依赖性凋亡途径均参与了细胞凋亡的调节。异丙酚对Caspase-3介导的Caspase依赖性凋亡途径和AIF介导的Caspase非依赖性凋亡途径均有调节作用,异丙酚通过抑制Caspase-3和AIF表达,减轻急性脊髓损伤大鼠神经元凋亡,我们的研究结果将为今后临床急性脊髓损伤后脊髓神经元的保护提供新的线索和方法。