力学刺激通过整合素α5β1介导半月板纤维软骨细胞的凋亡

杨化群,付岳松,王法正

(喀什地区第一人民医院运动医学科,喀什 844000;*通讯作者,E-mail:fz-wang1958@sina.com)

半月板退变性损伤是指由于外伤或长期负重导致的半月板磨损,从而诱发的膝关节功能紊乱[1]。半月板作为膝关节的重要部分承受50%以上的膝关节压力,长期的压力刺激是导致半月板损伤的关键因素[2]。半月板损伤修复是运动医学研究解决的关键问题。半月板纤维软骨细胞(meniscal fibrochondrocytes,MFs)是组织工程技术修复半月板损伤的重要种子细胞[3]。近年来,大量研究表明,力学刺激能够诱导半月板纤维软骨细胞凋亡[4]。因此,研究半月板纤维软骨细胞凋亡的分子机制,对于半月板损伤修复具有重要的意义。本研究探讨力学刺激对半月板纤维软骨细胞凋亡影响及分子机制,为半月板损伤的临床防治提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄雄性SPF级SD大鼠,体质量(260±20)g,由新疆天康生物股份有限公司(北区)提供,使用许可证编号:SYXK(新)2015-0003。

1.2 主要试剂

DMEM/F12细胞培养液、胎牛血清(FBS,美国Gibico公司),α5β1 siRNA(上海吉玛生物公司),HRP标记的二抗(武汉博士德生物),CCK8、Ⅰ型胶原酶(美国sigma公司),胰蛋白酶和透明质酸酶(北京索莱宝科技有限公司),Lipofectamine 2000(美国Thermo公司),Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(杭州联科生物科技有限公司),α5β1、cleaved caspase3、Bcl2 Rabbit mAb(美国abcam公司)。

1.3 半月板纤维软骨细胞的分离培养

酶消化法分离大鼠半月板纤维软骨细胞(meniscal fibrochondrocytes,MFs),手术无菌取大鼠双膝半月板,将半月板剪成小块(1 mm3),PBS洗涤,加入0.25%胰酶消化液和0.05%透明质酸酶孵育消化45 min,加入0.2%的Ⅱ型胶原酶37 ℃酶解5 h,将悬液过筛网(200目),离心(1 200g,10 min)取细胞沉淀,PBS洗涤细胞沉淀,加入DMEM/F12的培养液(含10% FBS),将细胞种植于细胞培养皿培养,细胞汇合至80%,传代培养。取第3代细胞用于后续实验。

1.4 细胞转染

取第3代的MFs细胞接种于6孔板,按照Lipofectamine 2000操作说明按比例将Lipofectamine 2000和α5β1 siRNA(control siRNA对照)混合后加入,于培养箱中培养4 h,去除六孔板内培养基,加新鲜10% FBS的DMEM/F12培养液于37 ℃、5% CO2培养24 h,用于力学刺激后的Western blot、CCK-8和细胞凋亡检测实验。

1.5 分组和力学刺激模型建立

首先将细胞分为两组,分别为对照组和力学刺激组,以确定力学刺激对MFs的影响。将取第3代的MFs细胞接按1×105个/孔接种于6孔加力板,细胞完全贴壁,然后将加力板置于应变加载系统给予力学刺激(10%牵张力,0.5 Hz,8 h/d),对照组不给与力学刺激,于37 ℃、5% CO2培养24 h,用于CCK-8和细胞凋亡检测实验。

其次将细胞分为四组,分别为对照组、力学刺激组、对照siRNA(NC-siRNA)力学刺激组和α5β1 siRNA力学刺激组,以检测α5β1siRNA对力学刺激的影响。其中NC-siRNA力学刺激组和α5β1 siRNA力学刺激组细胞为1.4转染NC-siRNA和α5β1 siRNA后的细胞。除对照组外,其余三组刺激组均给予上述同等条件的力学刺激,于37 ℃、5% CO2培养24 h,用于Western blot、CCK-8和细胞凋亡检测实验。

1.6 CCK-8法检测细胞活力

按照1.5分组和建模方法两次分别将细胞分为两组和四组,分别按上述两次分组方法进行处理。力学刺激MFs细胞24 h,然后每孔加入10%体积的CCK-8工作液(200 μl),于细胞培养箱培养2-3 h,于酶标仪450 nm下测定吸光值(OD450),OD450值代表细胞活力。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

按照1.5分组和建模方法两次分别将细胞分为两组和四组,分别按上述两次分组方法进行处理。力学刺激MFs细胞24 h,然后收集细胞,离心洗涤后按照试剂盒操作说明书加入流式缓冲液重悬细胞,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC避光反应10 min,再加5 μl PI避光反应5 min,立即用流式细胞仪进行检测,并统计细胞凋亡率。

1.8 Western blot检测α5β1,cleaved caspase3和Bcl2蛋白表达

采用1.5分组和建模的方式将细胞分为四组,分别为对照组、力学刺激组、NC-siRNA力学刺激组和α5β1 siRNA力学刺激组,给予力学刺激MFs细胞24 h,收集细胞蛋白样品,定量后取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离、转膜,5%脱脂奶粉封闭1 h,加入稀释(1 ∶500)的α5β1 Rabbit mAb,冰箱孵育过夜。洗涤后加入HRP标记的二抗(1 ∶5 000稀释),室温孵育1 h,洗涤后显色并拍照,进行灰度值统计分析。

1.9 统计学分析

实验数据采用Spss19.0软件进行分析,所有实验均至少重复3次,实验数据采用(平均值±标准差)表示。两组间的比较采用t检验,多组间的比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 力学刺激抑制MFs的细胞活力

我们检测了力学刺激对半月板纤维软骨细胞活力的影响,CCK8结果显示,与对照组(1.15±0.05)相比,力学刺激组细胞活力(0.72±0.08)显著降低,差异具有统计学意义(t=8.22,P<0.01,见图1)。

与对照组比较,**P<0.01图1 力学刺激对MFs细胞活力的影响Figure 1 The effect of mechanical stimulation on the viability of MFs

2.2 力学刺激促进MFs凋亡

流式细胞术结果显示,与对照组(5.47%±0.45%)相比,力学刺激组MFs凋亡率(21.17%±0.76%)显著升高,差异具有统计学意义(t=30.66,P<0.01,见图2)。

图2 流式细胞术检测力学刺激对纤维软骨细胞凋亡的影响Figure 2 The effect of mechanical stimulation on the apoptosis of MFs by flow cytometery

2.3 α5β1 siRNA抑制半月板损伤MFs活力

CCK-8检测结果显示,与NC-siRNA力学刺激组细胞活力(0.72±0.07)比较,α5β1 siRNA力学刺激组MFs细胞活力(1.17±0.06)显著升高,差异具有统计学意义(F=46.96,P<0.01,见图3)。

与NC-siRNA力学刺激组比较,**P<0.01图3 α5β1 siRNA对半月板损伤MFs增殖的影响Figure 3 The effects of α5β1 siRNA on the proliferation of MFs

2.4 α5β1 siRNA抑制力学刺激诱导的MFs凋亡

流式检测结果显示,与NC-siRNA力学刺激组(21.73%±0.55%)比较,α5β1 siRNA力学刺激组MFs凋亡率为(4.93%±0.51%)显著降低,差异具有统计学意义(F=640.2,P<0.01,见图4)。

2.5 α5β1 siRNA抑制MFs线粒体凋亡通路

Western blot结果显示,与对照组比较,力学刺激组α5β1和cleaved caspase3蛋白水平升高,Bcl2蛋白水平降低。与NC-siRNA力学刺激组比较,α5β1 siRNA力学刺激组细胞cleaved caspase3蛋白水平显著降低,Bcl2蛋白水平升高,差异具有统计学意义(F=104.2,P<0.01;F=127.6,P<0.01;F=1 041,P<0.01,见图5)。

与NC-siRNA力学刺激组比较,**P<0.01图4 流式细胞术检测α5β1 siRNA对半月板纤维软骨细胞凋亡的影响Figure 4 The effects of α5β1 siRNA on the apoptosis of MFs by flow cytometry

3 讨论

膝关节半月板损伤是指多由外力引起的膝关节局限性疼痛的疾病。半月板是胫骨关节面上的内侧和外侧半月形的一种纤维软骨组织,对于关节有着很好的稳定作用[5]。MFs是组织工程技术修复半月板损伤的重要种子细胞,对于半月板损伤修复具有重要的意义。

本研究通过酶消化法从大鼠半月板组织中成功分离出半月板纤维软骨细胞MFs,首先探讨了力学刺激对MF细胞活力和凋亡的影响。将分离的MFs分为对照组和力学刺激组两组,刺激组给予MFs力学刺激,条件为10%牵张力,0.5 Hz,8 h/d,CCK-8和流式细胞术检测结果表明,力学刺激能够抑制MFs活力,促进细胞凋亡。力学刺激如何影响MFs活力和凋亡还需要进一步实验阐明。

与对照组比较,**P<0.01;与NC-siRNA力学刺激组比较,##P<0.01图5 α5β1 siRNA对半月板纤维软骨细胞cleaved caspase3和Bcl2蛋白表达的影响Figure 5 The effects of α5β1 siRNA on the expression of cleaved caspase3 and Bcl2 in MFs by Western blot

α5β1也成为纤连蛋白受体,是一种由α5(CD49e)和β1(CD29)亚基组成的整合素。α5β1是纤连蛋白的主要受体,在细胞外机制信号转导中发挥重要的作用,能够与纤连蛋白相互作用调节关节软骨细胞中炎性细胞因子的作用[6]。α5β1作为细胞表面应力受体,参与肿瘤细胞的迁移和侵袭[7]。有研究表明,在力学刺激细胞的过程中,α5β1发挥重要的作用[8]。本研究发现力学刺激MFs凋亡的过程中α5β1表达显著升高,因此进一步探讨干扰α5β1对力学刺激促凋亡作用的影响。将细胞分为四组,分别为对照组、力学刺激组、NC-siRNA力学刺激组和α5β1 siRNA力学刺激组,进行转染和力学刺激。研究发现通过RNA干扰抑制α5β1,力学刺激对MFs的活力抑制作用降低,促凋亡作用也显著降低。这与其他学者的研究结果一致,表明力学刺激可能通过α5β1调节MFs凋亡等生物过程。

Bcl2(B-cell lymphoma 2)是由Bcl2凋亡调节蛋白家族成员之一。Bcl2凋亡调节蛋白家族包含促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白,抗凋亡蛋白Bcl2定位于线粒体的外膜,其在促进细胞存活和抑制促凋亡蛋白的作用中起重要作用[9-11]。研究表明,Bcl2基因损伤与肺癌、乳腺癌和前列腺癌等多种癌症的发生发展相关[12-14]。Caspase3蛋白是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族的成员,能够与caspase-8和caspase-9相互作用,在细胞凋亡的执行阶段起着重要作用[15]。Caspase3在线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径中均能够被激活[16]。本研究检测了力学刺激以及干扰α5β1对MFs中Bcl2蛋白和caspase3蛋白表达的影响,结果显示力学刺激能够抑制Bcl2的表达,促进cleaved caspase3蛋白表达,表明力学刺激能够激活MFs的线粒体凋亡通路。干扰α5β1能够促进Bcl2蛋白表达水平,抑制cleaved caspase3蛋白水平,表明干扰α5β1能够抑制力学刺激对MFs线粒体凋亡通路的影响。揭示力学刺激可能通过调控α5β1激活MFs的线粒体凋亡通路。

综上所述,本研究证实了力学刺激能够抑制MFs活力,激活线粒体凋亡通路,促进细胞凋亡,α5β1 siRNA能抑制力学刺激对线粒体凋亡通路的作用,抑制MFs凋亡,α5β1如何调控线粒体凋亡通路还需要进一步研究。本课题研究有助于阐明α5β1在力学刺激诱导MFs凋亡中的作用,为半月板损伤的治疗提供实验基础。