柚籽中类柠檬苦素的初提工艺研究

沈淑贤，邓淋萍，杨静娴，何 娣，丘苑新

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510225）

0 引言

柚子是芸香科柑橘属水果，在我国广东、广西、湖南、台湾等地种植非常广泛。柚子核富含脂肪油和蛋白质，含有黄柏酮、黄柏内酯、去乙酰闹米林及柠檬苦素类似物等成分。目前主要提取柚子核中促进人体健康及防治一些疾病的非营养性生理活性成分[1]。类柠檬苦素是具呋喃环的三萜类化合物。从柑橘属植物及相关植物中已分离出50多种类柠檬苦素，多为会使柑橘类果汁产生“后苦味”的水不溶性苷元[2]，另有17种无苦味且能溶于水的柠檬苦素类似物配糖体[3]，具有抗癌[4-5]、抗炎[6]、抑菌[7]、镇痛[8]等多种功效。然而，对柚籽中柠檬苦素的研究还缺少相关的报道。为促进柚子核中柠檬苦素的利用，试验以梅州沙田柚柚籽为原材料，在不同条件下亚临界萃取柚籽油及提取柚籽中的类柠檬苦素，分析其含量得率，从而得出最佳的萃取柚籽油和提取柠檬苦素的工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

沙田柚，梅州兴宁果园提供；丁烷，河南省亚临界生物技术有限公司提供；无水乙醇、对二甲氨基苯甲醛，广州市金华大化学试剂有限公司提供；冰醋酸、高氯酸，广州市锦旺化工有限公司提供；丙酮，广州市一马环保科技有限公司提供。

YB-700A型高速多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司产品；CBE-10L型亚临界萃取实验室成套设备，河南省亚临界生物技术有限公司产品；RV10型数显型立式旋转蒸发仪，河南省予华仪器有限公司产品；FD-2A-50型真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品；TU-1810SPC型可见紫外分光光度计，天津市普瑞斯仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 粗提物的提取

称取脱脂柚籽粉末2 g于锥形瓶中，加入一定量的一定体积分数的乙醇，恒温水浴浸泡3 h。过滤上层清液，真空蒸发浓缩至20 mL左右。将浓缩液冷冻至结冰。真空冷冻干燥得类柠檬苦素粗提物，采用分光光度法测定其含量。

1.2.2 紫外分光光度法测定类柠檬苦素含量

类柠檬苦素含量测定采用DMAB法[9]。

指示剂：准确量取冰醋酸100 mL，高氯酸80 mL，制备酸性母液；量取一半酸母液90 mL，添加对二甲氨基苯甲醛3.33 g，得到DMAB指示剂。

标准曲线的制作：精确称取柠檬苦素标准品5 mg，用丙酮定容至25 mL。分别准确吸取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，2.00 mL 标准溶液于1～8号试管中，丙酮定容至2.0 mL，依次迅速加入3 mL DMAB指示剂和3 mL酸母液，静置30 min完全显色后测量波长470 nm处的吸光度。分别以柠檬苦素质量浓度和吸光度为横坐标与纵坐标，绘制标准曲线。

柠檬苦素标准曲线见图1。

图1 柠檬苦素标准曲线

用丙酮将各个工艺条件下得到的类柠檬苦素粗提物粉末定容至10 mL，按照上述同样的方法测定其于波长470 nm处的吸光度，并根据标准曲线和以下公式计算柚籽中类柠檬苦素含量。

式中：C——吸光度所对应的含量，mg/mL；

V——样品定容体积，mL；

M——所称取的脱脂柚籽质量，g。

1.2.3 单因素试验

分别研究乙醇体积分数、提取温度、料液比对类柠檬苦素粗提物含量的影响，确定影响类柠檬苦素提取率的主要因素。

1.2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，选取L9（34）正交表进行正交试验，乙醇体积分数、提取温度、料液比为因素，以所提取的类柠檬苦素粗提物含量为测定指标。

乙醇提取柚籽中类柠檬苦素试验因素与水平设计见表1。

表1 乙醇提取柚籽中类柠檬苦素试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 乙醇提取脱脂柚籽中类柠檬苦素的单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对类柠檬苦素粗提物含量的影响类柠檬苦素提取含量随不同乙醇体积分数的变化趋势见图2。

图2 类柠檬苦素提取含量随不同乙醇体积分数的变化趋势

由图2可知，乙醇体积分数不断增加，柠檬苦素类化合物的提取效果越好。乙醇体积数在80%时，提取效果最好。但体积分数继续增加提取率会降低，这可能与乙醇的极性有关。因此，选择乙醇体积分数80%。

2.1.2 提取温度对类柠檬苦素粗提物含量的影响

类柠檬苦素提取含量随不同提取温度的变化趋势见图3。

图3 类柠檬苦素提取含量随不同提取温度的变化趋势

由图3可知，类柠檬苦素粗提物的得率随温度升高不断增加，70℃时，含量达到最高峰，之后升高温度，得率缓慢下降。提高萃取温度可使分子的热运动速度加快，提高溶质的溶解度和扩散速率。但萃取温度过高会导致溶质中的热敏性成分容易被分解破坏[10]、能量消耗过大和操作困难。因此，最合适的提取温度为70℃。

2.1.3 料液比对类柠檬苦素粗提物含量的影响

类柠檬苦素提取含量随不同料液比的变化趋势见图4。

图4 类柠檬苦素提取含量随不同料液比的变化趋势

由图4可知，柚籽柠檬苦素粗提物的含量随料液比的增加而增加，料液比从1∶15增加到1∶35时，增加速度较快；到1∶35之后，提取率变化不大。因此选择1∶45的比例更合适。

2.2 正交试验结果

乙醇提取柚籽类柠檬苦素粗提物正交试验结果见表2。

表2 乙醇提取柚籽类柠檬苦素粗提物正交试验结果

通过对正交数据的直观分析，比较试验中A，B，C 3个因素中极差R值的大小，可以看出其影响的主次顺序为C＞B＞A，即料液比对柚籽中的柠檬苦素类似物的提取影响最大，其次为提取温度，乙醇体积分数影响最小。

根据K值，按照各因素的最好水平选取最优的水平组合为A1B2C2，即乙醇体积分数70%，提取温度70℃，料液比1∶45。经验证试验，柚籽中类柠檬苦素的提取率为3.422 mg/g。

乙醇体积分数、提取温度、料液比含量趋势图见图6。

通过图6可以直观看出指标与3个因素水平的波动关系，随着乙醇体积分数的增大，柠檬苦素的含量不断下降，故A1为最优水平；随着提取温度的升高，柠檬苦素含量先增加至B2水平后降低，故B2为最优水平；柠檬苦素含量随着料液比的增大先上升至C2水平后降低，故C2为最优水平；因此，类柠檬苦素的最优提取工艺条件是乙醇体积分数70%，提取温度70℃，料液比1∶45。

图6 体积分数、提取温度、料液比含量趋势图

3 结论

在柚籽脱脂的条件下，采用单因素试验和正交试验相结合的方法，对各个因素的分析得到柚籽中类柠檬苦素的最佳初提工艺条件为乙醇体积分数70%，提取温度70℃，料液比1∶45。

无水乙醇可以重复回收利用，绿色无污染，节约成本，与其他萃取剂相比减少了对环境的污染。受试验原材料和器材的限制，萃取剂的用量过于饱和，应当继续减少萃取剂的用量，找到更合适的料液比。通过查阅资料，试验中通过乙醇浸提并没有把柚籽中的类柠檬苦素完全提取出来，接下来的研究可以尝试用其他的溶剂进行提取或添加水溶助剂、利用超声波辅助等对类柠檬苦素进行提取。