不同批次广东王不留行芦丁和绿原酸的含量比较

袁德俊，吴 涵，梁馨文，黄晓冰

（1.广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510240；2.中山大学新华学院，广东 广州 510520）

广东王不留行为桑科植物薜荔（Ficuspumila L.）的干燥瘾头花序托，别名为薜荔果、木莲、络石藤、风不动、常春藤等，主产于广东、广西、湖南、江西等地，具有祛风利湿、活血解毒的功效，用于风湿痹痛、泻痢、淋病、跌打损伤、痈肿疮疖的治疗［1］。《中华人民共和国药典》记载的王不留行为石竹科植物麦蓝菜Vacaria Segetalis（Neck）Carcke的干燥成熟种子 ，具有活血通经、下乳消肿的功效，主治痛经、闭经、产后乳汁不下及乳痈肿痛等［2］，是全国使用和流通的王不留行的正品。然而，广东、广西等地区习惯将广东王不留行当作王不留行使用［3］，事实上两者在来源、用药部位及功效等方面差异都较大。有关广东王不留行化学成分的文献研究不多，有报道其花序托含芦丁、内消旋肌醇、芸香苷、β-谷甾醇等成分［1］，曾颂等［4-5］学者对其槲皮素、芦丁和绿原酸的含量进行了测定。为对广东王不留行的药材质量进行更深入的研究，本研究采用HPLC同时测定广东王不留行中芦丁和绿原酸的含量，并对不同批次、不同厂家的含量进行比较分析，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（日本岛津，型号为LC-20AT）；紫外可见分光光度计（北京普析公司，型号为TU-1901）；电子天平（北京普析公司，型号为MSE125P-OCE-DU）；超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药 绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，含量为96.8%，批号：110753-201817）；芦丁对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，含量＞98%，批号：L-001-170426）；乙腈（色谱纯）；其余试剂均为分析纯。10批次广东王不留行批号及收集地分别为：1608001（岭南）、170304001（清平市场）、170301（至信）、1705001（岭南）、170304002（清平市场）、1701001（岭南）、170304003（清平市场）、160801（至信）、161101（至信）、1808001（岭南），产地均为广东，经吴康郁副主任中药师鉴定为桑科植物薜荔的干燥瘾头花序托的炮制加工品。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品5.50 mg，置25 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为芦丁对照品储备液（228μg/ml）；精密称取绿原酸对照品5.48 mg，置25 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为绿原酸对照品储备液（219μg/ml）。精密量取上述储备液各1 ml置于5 ml量瓶中，加50%甲醇溶液稀释并定容至刻度，摇匀即得混合对照品溶液（芦丁和绿原酸浓度分别为45.6 μg/ml、43.8 μg/ml）。

2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约1.00 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SPC18柱（150mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱的情况见表1；紫外检测器波长：251 nm；液相色谱柱温度：30℃；流速：1.0 ml/min；进样量：10μl；理论板数按芦丁峰计应不低于3 000［6］。精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，按上述色谱条件进样测定，结果芦丁和绿原酸与其他成分能得到较好的分离，其分离度均大于1.5。见图1。

表1 流动相梯度洗脱条件

图1 HPLC色谱图

2.4 线性关系的考察 分别精密量取上述绿原酸对照储备液 0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml和上述芦丁对照储备液 0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，分别置于对应5个10 ml量瓶中，加50%甲醇溶液稀释定容至刻度，摇匀，即得各混合对照品系列溶液。分别精密吸取上述各混合对照品系列溶液10μl，注入液相色谱仪，按上述含量测定方法测定，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制绿原酸和芦丁的标准曲线，得绿原酸的回归方程为：Y=12 171X-6 537（r2=0.9993）；芦丁的回归方程为：Y=17 196.1X-2 315.36（r2=0.9995）。绿原酸和芦丁分别在9.60～76.80μg/ml和4.08～20.40μg/ml范围内呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取10μl绿原酸和芦丁的混合对照品溶液，注入液相色谱仪，重复进样6次，按上述色谱条件测定峰面积，测得绿原酸的峰面积RSD为1.23%（n=6），芦丁的峰面积RSD为1.06%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，按上述含量测定方法，分别在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h取10 μl样品进样测定，同时记录不同时间下对应的峰面积，并根据峰面积计算出样品中绿原酸和芦丁的浓度。结果显示绿原酸和芦丁的RSD分别为0.45%（n=7）和0.46%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 选取同一批广东王不留行药材（批号：161101）6份，按2.2项方法制备供试品溶液，分别进样10μl测定峰面积，计算含量，结果绿原酸平均含量为45.79 μg/ml，RSD为1.89%（n=6）；芦丁平均含量为7.05μg/ml，RSD为2.27%（n=6），表明本方法的重复性良好。

2.8 加样回收试验 取6份广东王不留行供试品（含量已知），分别称取1.00 g，并加入不同质量的绿原酸和芦丁对照品，在2.1色谱条件下每个样品重复测定3次计算样品的回收率，见表2。

表2 绿原酸、芦丁加标回收试验结果

2.9 绿原酸、芦丁的含量测定 取不同收集地、不同批次的广东王不留行样品，按2.2方法制备供试品溶液，并按2.3色谱条件进样测定，结果见表3和表4。

3 讨 论

本实验通过比较不同比例的流动相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），发现按表1所示比例进行梯度洗脱，能使广东王不留行中绿原酸和芦丁得到较好的分离效果。此外，超声提取法提绿原酸和芦丁较煎煮法、乙醇回流法在操作上更简便，且提取率较高［7］。

通过对绿原酸和芦丁的含量测定，不同收集地、不同批次的绿原酸含量差异不大，而芦丁的含量差异较大，可能与产地、贮藏、炮制工艺有关。相同收集地的不同批次样品的绿原酸平均含量相比较，岭南＞至信＞清平市场；而芦丁平均含量相比较，至信＞岭南＞清平市场，这可能与药材采收季节、果实的成熟度不一致有关。

广东王不留行是岭南常用药材，尚未收录在《中华人民共和国药典》，本实验建立了该药材中芦丁和绿原酸的含量测定方法，该方法快捷、准确，可为完善广东王不留行的药材质量标准提供依据。

表3 不同批次样品中绿原酸、芦丁的含量比较 （μg/ml）

表4 相同收集地的不同批次样品中绿原酸、芦丁的含量比较 （μg/ml）