复方雷公藤微乳凝胶释放度与体外透皮特性的研究

王晓娟，李 娟，李 周

（1.洛阳市第二中医院，河南 洛阳 471003；2.广州中医药大学，广东 广州 510006）

复方雷公藤处方由雷公藤、川芎、炙乳香和炙没药等中药组成，是用于治疗类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的临床经验处方，其中雷公藤为方中主药。雷公藤已经广泛用于RA等免疫系统疾病的治疗，疗效确切，几乎没有可以替代的中药［1-2］，但是雷公藤具有较大的毒性，且有效剂量和中毒剂量接近，口服雷公藤制剂容易因为剂量问题而造成毒副反应［3］，为了减少雷公藤口服给药所造成的毒性反应，本课题组拟将复方雷公藤开发成经皮给药制剂——微乳凝胶。微乳凝胶（microemulsion based gels，MBGs）是近十几年来兴起的一种新剂型，它是由油相、表面活性剂和助表面活性剂组成的透明、均一的热力学稳定体系［4］。微乳能增加药物的溶解度和经皮渗透性，延长药物作用时间［5］，但是微乳的流动性强，黏附性差。因此，为了适合经皮给药，通常将微乳进一步制成微乳凝胶。本研究以雷公藤中主要有效成分之一的雷公藤甲素为指标，对复方雷公藤微乳凝胶体外释放度进行了考察，同时比较了复方雷公藤微乳凝胶、复方雷公藤凝胶以及复方雷公藤巴布剂的体外透皮特性，为将复方雷公藤处方开发成微乳凝胶提供实验依据。

1 实验材料

1.1 仪器 TK-12A型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司，515泵，2487紫外检测器）；N3000色谱工作站（浙江大学）；AUW120D十万分之一分析天平（日本岛津）；DLB200电子天平（日本岛津）。

1.2 试药与试剂 复方雷公藤提取物（雷公藤甲素的含量为0.128%，实验室自制）；透析袋（MWCO：8 000～14 000，上海金穗生物科技有限公司）；油酸（广州化学试剂厂）；OP乳化剂（天津市福晨化学试剂厂）；卡波姆940（CP-940，广州化学试剂厂）；三乙醇胺（广州化学试剂厂）；无水乙醇（天津市百世化工有限公司）；壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯（广州化学试剂厂）；乳酸（鱼台海纳环保科技有限公司）；壳聚糖（济宁佰一化工有限公司）；卡拉胶（深圳安泰生物科技有限公司）；雷公藤甲素标准品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：140424）；甲醇（色谱纯，迪马公司）；水为蒸馏水；其它试剂均为分析纯。

1.3 动物 健康雌性昆明种小鼠，体质量20±2 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2008-0020。

2 方法与结果

2.1 复方雷公藤微乳凝胶、复方雷公藤凝胶、复方雷公藤巴布剂的制备

2.1.1 复方雷公藤微乳凝胶的制备 经前期预试验确定复方雷公藤微乳凝胶的制备方法：在室温下取复方雷公藤提取物1.5 g加入到1.58 g油酸中超声溶解，然后加入壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯7.58 g、OP乳化剂1.89 g、无水乙醇4.73 g，超声搅拌均匀，在磁力搅拌器作用下逐滴加入80.72 g水，搅拌0.5 h，即得复方雷公藤微乳；将2 g卡波姆940加入到制备好的复方雷公藤微乳中，溶胀24 h，用三乙醇胺调节pH6～7，搅拌均匀，即得复方雷公藤微乳凝胶，载药量为1.5%。

2.1.2 复方雷公藤凝胶的制备 取2 g卡波姆940用适量蒸馏水进行溶胀，再取1.5 g复方雷公藤提取物用10 ml乙醇进行溶解，加入5 g甘油，混合均匀后一并加入到卡波姆940溶液中，搅拌均匀后，加入三乙醇胺调节pH6～7，加水至100 g，制备得载药量为1.5%的复方雷公藤凝胶。

2.1.3 复方雷公藤巴布剂的制备 参考专利“雷公藤巴布剂的制备方法（公开号：CN102008536A）”［6］制备复方雷公藤巴布剂，具体制备方法如下：将0.15 g乳酸加水15 ml混匀，然后加入0.75 g壳聚糖，加热至40～65℃搅拌使完全溶解，并混合均匀，作为A相；将18 g聚乙烯醇加水24 ml，加热至55～80℃溶解，搅拌均匀，作为B相；将1.5 g明胶加水12 ml，加热至40～60℃搅拌使完全溶解，并混合均匀，作为C相；将12 g聚乙烯毗咯烷酮和3 g卡拉胶加水33 ml，加热至40～60℃搅拌使完全溶解，并混合均匀，作为D相。将A、B两相混合，在40～65℃下搅拌依次加入C相和D相，然后加入12 g甘油，在40～60℃温度下混匀即得巴布剂基质。取1.5 g复方雷公藤提取物加入到上述方法制备好的基质中，搅拌数分钟，涂布，即得复方雷公藤巴布剂，巴布剂最终大载药量为1.2%。

2.2 雷公藤甲素的含量测定

2.2.1 对照品贮备液的制备 精密称取雷公藤甲素2.23 mg置于10 ml的量瓶中，用甲醇定容至刻度，振摇即得浓度为223μg/ml的雷公藤甲素对照品贮备液。

2.2.2 阴性样品溶液的制备 将无水乙醇与生理盐水按4∶6的比例混合均匀，即得阴性样品（空白接收液）。

2.2.3 供试品溶液的制备 体外释放度试验供试品溶液的制备：取雷公藤微乳凝胶扩散池接收液，过0.22μm微孔滤膜，即得。体外透皮试验供试品溶液的制备：取复方雷公藤微乳凝胶、复方雷公藤凝胶及复方雷公藤巴布剂体外透皮接收液，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.2.4 色谱条件色谱柱为Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-水（45∶55），流速为1.0 ml/min，检测波长为218 nm，进样量为10 μl，柱温为25℃。理论塔板数按雷公藤甲素峰计算应不低于4 000，色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图

2.2.5 标准曲线的制备 将雷公藤甲素对照品贮备液进行倍比稀释，得到雷公藤甲素浓度为0.112μg/ml、0.223 μg/ml、0.446 μg/ml、1.115 μg/ml、2.23 μg/ml、4.46 μg/ml、8.92 μg/ml的对照品系列溶液，按照2.2.4项下色谱条件依次进样，进样量为10μl，以峰面积（Y）对对照品浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y=13 978X+9 560.5，r=0.999 9，说明雷公藤甲素在0.112～19.84μg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验 取8.92μg/ml的对照品溶液10μl，连续重复进样6次，测得雷公藤甲素峰面积并计算其RSD值。结果RSD为1.12%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 将2.2.3项下所制备的供试品溶液置于冷藏（0～4℃）、避光条件下储存，取同一供试品溶液，按照2.2.4项下色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 进样，进样量为10 μl，测定峰面积并计算其RSD值。结果RSD为1.37%（n=7），表明雷公藤甲素在24 h内稳定性良好。

2.3 体外释放度试验［7-8］采用改良Franz扩散池进行实验，扩散池容积为8 ml，有效扩散面积为3.14 cm2。将已处理过的半透膜置于供给池和接收池之间，供给池中均匀涂抹复方雷公藤微乳凝胶1 g，供给池上端用封口膜封口以免杂质掉落，接收室中加入已超声脱气的乙醇-生理盐水（4∶6），将供给池与接收池用铁夹固定，缝隙用石蜡密封，防止同批扩散池水浴中的水进到供给池中。调节温度至32±0.5℃，恒速搅拌（约200 r/min），分别于实验开始后的1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h从样品接收室吸取1 ml接收液，同时向接收室中补加同温度同体积的空白接收液。将所吸取的接收液用0.22μm微孔滤膜过滤后，按2.2.4项下色谱条件进样分析，并按下式计算累计渗透量（Qn）、渗透速率常数（J），并计算累计释放率（R）。

式中，Qn：第n个时间点的累计面积透过量（μg/cm2）；V：接收室中接收液的总体积（8 ml）；Vi：每次的取样体积（1 ml）；Cn：第n个取样点测得的药物质量浓度（μg/ml）；A：有效扩散面积（3.14 cm2）；J：释放速率常数/透皮速率常数［μg/（cm2·h）］，M为1 g复方雷公藤微乳凝胶中的雷公藤甲素的量，即19.22μg。

求得累积渗透量之后，将累积渗透量Q对时间t进行方程拟合，并求得回归系数r，回归系数最大的方程即为最佳拟合方程，分别有下列三种方式：零级方程 Q=at+b；一级方程 lnQ=at+b；Higuchi方程Q=at1/2+b，结果见表1。

表1 雷公藤甲素释放度方程的拟合 （n=3）

从表1可以看出，根据回归系数r可知，雷公藤甲素在复方雷公藤微乳凝胶中释药特性符合零级释药方程Q=1.25t+2.67，即药物没有突释也没有迅速释放（一级方程），而是基本上以恒定的速率释药，释药速率为1.25μg/（cm2·h）；雷公藤微乳凝胶在12 h内的累积释药量达到91%，释药较完全。复方雷公藤微乳凝胶符合经皮给药制剂释放度的要求。

2.4 体外透皮实验［9］

2.4.1 离体鼠皮的制备与保存 取健康小鼠，用电动

剃毛机剃去小鼠腹部毛，再用6%的硫化钠溶液对剩余的毛发进行脱除，两天后小鼠脱臼处死，小心剥离腹部皮肤，剔除皮下脂肪组织及粘连物，用生理盐水反复冲洗干净，置于-20℃冰箱中保存备用（一个星期内使用完）。实验前自然解冻，每次实验前检查皮肤的完整性，不能有任何破损。

2.4.2 透皮实验方法 参照2.3项下体外释放度试验方法进行，将供给池和接收池之间的屏障由半透膜换成离体小鼠腹部皮肤，角质层朝上（供给池），分别将复方雷公藤微乳凝胶1 g、复方雷公藤凝胶1 g和复方雷公藤巴布剂0.8 g均匀涂抹于小鼠皮肤之上，开始进行体外透皮试验，测得不同制剂不同时间（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h）接收池中雷公藤甲素药物浓度，并计算累积透皮量，同时对时间进行回归，求得Q-t方程，以透皮速率为指标比较复方雷公藤微乳凝胶、复方雷公藤凝胶和复方雷公藤巴布剂三者的透皮性能，结果如表2、图2。

表2 不同制剂中雷公藤甲素经皮渗透实验结果 （±s，n=3）

表2 不同制剂中雷公藤甲素经皮渗透实验结果 （±s，n=3）

制剂复方雷公藤微乳凝胶复方雷公藤凝胶复方雷公藤巴布剂经皮渗透回归曲线Q=0.419t+0.917 Q=0.205t+0.093 Q=0.253t+0.040 Q24 h（μg/cm2）11.24±1.03 4.94±0.26 6.12±0.42 J［μg/（cm2·h）］0.419 0.205 0.253

图2 不同制剂中雷公藤甲素经皮渗透Q n对t曲线

从表2和图2可知，复方雷公藤微乳凝胶、复方雷公藤巴布剂、复方雷公藤凝胶24 h的体外累积透皮量与时间的曲线方程分别为Q=0.419t+0.917、Q=0.253t+0.040、Q=0.205t+0.093，其中复方雷公藤微乳凝胶的透皮速率为0.419μg/（cm2·h），均大于复方雷公藤巴布剂［0.253μg/（cm2·h）］和复方雷公藤凝胶［0.205μg/（cm2·h）］，表明复方雷公藤微乳凝胶体外透皮特性优于复方雷公藤凝胶剂和复方雷公藤巴布剂，适合开发成经皮给药制剂。

3 讨 论

本试验研究中，透皮扩散池的接收液为40%乙醇溶液（乙醇∶水为4∶6），是因为在预实验中发现雷公藤甲素在40%乙醇溶液中溶解度较好，在进行透皮扩散试验时符合漏槽条件，因此选择其作为透皮扩散试验的接收液；在2.4.2项体外透皮试验中，复方雷公藤微乳凝胶、复方雷公藤凝胶与复方雷公藤巴布剂给药量有所不同，这是因为复方雷公藤巴布剂的载药量与前两者不同，为了保证给药量中雷公藤甲素的含量一致，因此调整了复方雷公藤巴布剂的给药量。采用硫化钠对小鼠皮肤进行脱毛时，由于硫化钠具有较强的碱性，会对皮肤角质层造成一定程度上的破坏，从而改变皮肤对药物的透过性，因此，本实验在用硫化钠对小鼠腹部皮肤脱毛后，要过两天再取小鼠皮肤，目的是让小鼠皮肤自然恢复。

研究表明，复方雷公藤微乳凝胶体外释放速率为1.25μg/（cm2·h），远大于其透皮速率0.419μg/（cm2·h），因此复方雷公藤微乳凝胶的释放不是其透皮速率的限速环节，其释放行为符合零级方程，即可以达到平稳缓慢释药，一方面不会由于快速释药而导致透皮吸收过快、体内药物浓度过高而造成毒性反应，另一方面可以维持较久的给药时间，无需频繁给药，因此满足经皮给药制剂的要求。复方雷公藤微乳凝胶透皮特性优于复方雷公藤凝胶和复方雷公藤巴布剂，说明了微乳可以促进药物的经皮吸收，加之巴布剂的成型工艺复杂，因此复方雷公藤处方更适合开发成微乳凝胶。