复方半枝莲颗粒对肝纤维化中PI3K/Akt信号通路的影响

夏钰淇，杨 洋，尚振中，李中华

（1.广西中医药大学基础医学院，广西 南宁 530200；2.南通卫生高等职业技术学校，江苏 南通 226000）

肝纤维化是一种可逆的伤口愈合反应，是肝脏在不同的代谢、病毒和毒性刺激下发生急性或慢性损伤的特征。肝纤维化最终会导致肝硬化和各种并发症，如肝衰竭和门脉高压、肝细胞癌［1-3］。据报道，肝星状细胞（HSCs）的增殖和活化在肝纤维化的发生中起着关键作用［4］。HSCs活化引起透明质酸、层粘连蛋白和胶原蛋白等细胞外基质的合成、降解异常和过分沉积，形成肝纤维化［5］。目前已有研究表明，PI3K/Akt信号通路和肝纤维化之间存在着密切的联系，通过抑制PI3K/Akt信号通路可以减少细胞外基质的沉积，并且抑制HSCs的增殖，促进其凋亡，从而达到治疗的目的［6-11］。复方半枝莲颗粒由半枝莲、墨旱莲、柴胡、黄芪、党参等组成，临床用于治疗肝炎疗效良好，为进一步明确其药理作用，本研究基于PI3K/Akt信号通路，探讨复方半枝莲颗粒的抗肝纤维化作用机制，以丰富其治疗肝纤维化的理论依据。

1 实验材料

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠56只，体质量180～200 g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物合格许可证号：SCXK桂2009-0002。大鼠分笼饲养，每笼6只，进行适应性饲养1 w，养殖环境室内温度设置为22～26℃、相对湿度40%～70%。

1.2 主要药物、试剂和仪器设备

1.2.1 药物 复方半枝莲颗粒由半枝莲30 g、墨旱莲15 g、柴胡9 g、黄芪9 g、党参6 g、三棱3 g、莪术3 g、当归3 g、白芍9 g、大枣9 g组成，采用江阴天江药业有限公司的配方颗粒调剂而成，将颗粒加蒸馏水配置成含生药量为1 g/ml的溶液，保存备用；秋水仙碱（云南号邦制药有限公司生产，每片0.5 mg，国药准字H53021798）；大黄䗪虫丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产，每丸3 g，批准文号：国药准字Z11021241）。

1.2.2 试剂 四氯化碳（CCl4）、10%水合氯醛、4%多聚甲醛溶液、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、肝素钠、亚硝酸钠、免疫组化试剂盒、PI3 Kinase p85一抗（CST）、Antirabbit IgG二抗（CST）、二甲苯、无水乙醇、甲醇、抗体稀释液、蛋白检测试剂盒、ECL显影试剂盒、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。

1.2.3 仪器 低温离心机、精密电子天平仪、电热恒温干燥箱、电热恒温水浴箱、电子天平、微波炉、电泳仪、转膜仪、摇床、超低温冰箱、显影仪、光学电子显微镜。

2 实验方法

2.1 分组与造模及取样方法 经适应性养殖后，将56只大鼠按随机法分为7组：正常对照组（A组）、模型对照组（B组）、秋水仙碱对照组（C组）、大黄䗪虫丸对照组（D组）、复方半枝莲颗粒高剂量组（E组）、复方半枝莲颗粒中剂量组（F组）、复方半枝莲颗粒低剂量组（G组），每组8只。除正常对照组外，余组采用40%CCl4复合因素干预法制备大鼠肝纤维模型［12］：予造模大鼠首次腹腔注射40%CCl4油剂，剂量为5 ml/kg，以后每隔3日腹腔注射1次，剂量不变。与此同时，采用高脂低蛋白食物喂养，除正常对照组正常饮食外，余各组实验大鼠均予15%的酒精饮料替代饮用水。4 w之后，病理检查结果证实肝纤维化模型已经建立成功。成模后，正常对照组及模型对照组正常饮食；秋水仙碱对照组灌胃给予秋水仙碱溶液，剂量为0.0025 g/kg；大黄䗪虫丸对照组灌胃给予大黄䗪虫丸溶液，剂量为0.315 g/kg；复方半枝莲颗粒高、中、低剂量组根据体重分别灌胃给予复方半枝莲颗粒溶液，剂量为28 g/kg、14 g/kg、7 g/kg。每天上午空腹灌胃1次，共4周。末次用药24 h后，根据大鼠体重按3 ml/kg剂量予10%水合氯醛溶液腹腔注射，麻醉后摘取大鼠肝脏，断颈处死。

2.2 免疫组化法 将肝组织石蜡切片整个置于二甲苯中脱蜡5 min；依次置于无水酒精、95%酒精、75%酒精中进行梯度脱水，各5 min；用PBS冲洗3次，每次3 min；将干组织切片置于沸腾（98～100℃）的0.01M枸橼酸缓冲液中，冷却5～10 min，反复2次；滴加3%去离子水孵育10 min；用PBS冲洗3次，每次3 min；滴加封闭用正常山羊血清，室温封闭15 min；滴加稀释后的一抗，4℃环境下孵育过夜；用PBS冲洗3次，每次3 min；滴加生物素化二抗，37℃环境下孵育15 min；用PBS冲洗3次，每次3 min；滴加辣根酶标记的链酶卵白素，37℃环境下孵育15 min；用PBS冲洗3次，每次3 min；DAB显色。

2.3 蛋白免疫印迹法（Western blot） 取绿豆大小的肝脏组织放在1.5 ml EP管中置于冰上，加入RIPA裂解液和PMSF（PMSF∶RIPA=1∶100），进行匀浆。将加入裂解液的EP管放入冰盒内保存，进行超声。4℃低温离心，12 000 rpm，10 min。离心结束后用20μl枪头小心吸取透明部分上清液（即蛋白）移至新的EP管中并插入冰中等待下一步检测。采用BCA试剂盒检测标记好的样本蛋白浓度。蛋白变性：按蛋白检测结果计算加入Buffer量，调整至所需的蛋白浓度，混匀,并将蛋白样品进行金属浴，98℃，8 min；配制8%的分离胶。电泳：先80 V，30～40 min；再120 V，1 h。转膜：一般300 mA 1 h。室温封闭1 h。一抗孵育：将膜从封闭液中取出，在标记好的孵育盒中加入6 ml的TBST，摇床洗3次，每次10 min。按标记顺序取出膜加入相对应稀释好的一抗，做好标记后4℃孵育过夜。二抗孵育：取出膜，在标记好的孵育盒加入6 ml的TBST，摇床洗3次，每次10 min，加入按相应比例稀释好的二抗，室温，摇床孵育1 h。显影。

2.4 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用非配对t检验比较各实验组数据，以P＜0.05为有统计学差异。

3 结 果

3.1 各组动物的一般情况 经病理切片鉴定造模成功后，对各治疗组实验大鼠进行为期4 w的相对应药物的灌胃治疗，经过4 w治疗后观察到，与模型对照组（B组）大鼠的一般状况相比较，C、D、E、F组大鼠精神萎靡的情况好转较为明显，活动逐渐活跃，饮食状况改善，尤其以D组实验大鼠一般情况改善最明显。

3.2 免疫组化检测各组大鼠肝组织中PI3K和Akt蛋白表达情况 见表1。模型对照组大鼠肝脏组织PI3K、Akt表达量均显著高于正常对照组（P＜0.05）；经治疗后，各治疗组大鼠肝脏组织PI3K、Akt表达量均显著低于模型对照组（P＜0.05）。

3.3 Western blot法检测各组大鼠肝组织中PI3K和Akt蛋白表达情况 见图1、表2。模型对照组大鼠肝脏组织PI3K、Akt表达量均显著高于正常对照组（P＜0.05）；与模型对照组比较，各治疗组大鼠肝组织PI3K的蛋白表达量显著下降（P＜0.05），除复方半枝莲颗粒低剂量组外，其余各治疗组的Akt蛋白表达量也显著下降（P＜0.05）。

表1 免疫组化检测各组大鼠肝组织中PI3K及Akt的蛋白表达结果 （± s）

表1 免疫组化检测各组大鼠肝组织中PI3K及Akt的蛋白表达结果 （± s）

注：与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型对照组比较，②P＜0.05

组 别正常对照组模型对照组秋水仙碱对照组大黄䗪虫丸对照组复方半枝莲颗粒高剂量组复方半枝莲颗粒中剂量组复方半枝莲颗粒低剂量组n 8 8 8 8 8 8 8 PI3K 23.42±3.34 71.23±11.13①29.22±4.37②27.82±3.66②11.73±3.61②20.58±2.68②45.18±7.35②Akt 19.50±5.93 57.73±10.03①33.30±5.75②26.27±3.47②12.09±3.51②27.25±5.72②31.00±8.82②

图1 各组PI3K/Akt蛋白表达

表2 Western blot检测各组大鼠肝组织中PI3K及Akt的蛋白表达结果 （±s）

表2 Western blot检测各组大鼠肝组织中PI3K及Akt的蛋白表达结果 （±s）

注：与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型对照组比较，②P＜0.05

组 别正常对照组模型对照组秋水仙碱对照组大黄䗪虫丸对照组复方半枝莲颗粒高剂量组复方半枝莲颗粒中剂量组复方半枝莲颗粒低剂量组n 8 8 8 8 8 8 8 PI3K 0.97±0.44 2.31±0.47①1.77±0.59②1.43±0.49②1.20±0.29②1.66±0.37②1.74±0.26②Akt 1.19±0.22 1.60±0.16①1.50±0.21②1.30±0.25②1.17±0.36②1.38±0.20②1.52±0.31

4 讨论

肝纤维化是由于肝脏持续损伤，肝组织自我修复时引起的肝组织内细胞外基质的异常合成降解与过度沉积［13］。中医文献中并没有关于肝纤维化的相关记载，根据其临床症状及表现，肝纤维化属于中医文献中“积聚”“肝积”“黄疸”“胁痛”“臌胀”等范畴。肝纤维化的中医病因病机较为复杂，多为情志不畅、正气虚损、感受湿热毒邪等导致的湿热内蕴、肝失疏泄、气滞血瘀、肝脾受损、脏腑气机失调。复方半枝莲颗粒中半枝莲消炎除积为君药，墨旱莲、三棱、莪术抗炎消肿、活血通络、软坚消癥为臣药，佐以黄芪补虚扶正，党参、柴胡疏肝健脾益气，当归、白芍、大枣养血柔肝，缓和药性，共奏抗炎消积、软坚消癥、益气柔肝之效。

PI3K/Akt信号通路是肝纤维化形成过程中的一条重要信号通路，该通路通过调控HSCs的活化和凋亡来干预肝纤维化的进程，HSCs的增殖在肝纤维化形成过程中起到了关键作用，治疗的关键也是通过抑制HSC的增殖，促进其凋亡。从大量文献［6-11］的实验结果可知，PI3K/Akt信号通路参与了肝纤维化的进程，参与介导调控HSCs细胞的增殖与凋亡。本研究通过复方半枝莲颗粒干预CCl4造模的肝纤维化大鼠，深入研究复方半枝莲颗粒对PI3K/Akt信号通路，调控HSCs活化、凋亡和ECM合成降解的影响。免疫组化检测结果显示，模型对照组PI3K及Akt表达量一直维持高表达，而复方半枝莲颗粒各剂量组的PI3K及Akt蛋白表达量呈现明显的抑制。Western blot检测结果显示，与模型对照组比较，各治疗组的PI3K蛋白表达量均显著下降，除复方半枝莲颗粒低剂量组的Akt蛋白表达量下降不明显外，余治疗组的Akt蛋白表达量也显著下降。检测结果提示，复方半枝莲颗粒在作用于PI3K/Akt信号通路时也可能参与抑制了与该通路紧密相关的HSCs增殖或促进了其凋亡，从而抑制了肝纤维化的进程。