獐牙菜苦苷对糖尿病周围神经痛大鼠血清炎性因子水平的影响

王保，姚嘉茵，鲁义，卿朝辉，劳俊铭，刘栋，邱桂华，尧新华*

(1.广州市中医医院麻醉科，广东 广州 510130；2.中山大学附属第六医院消化内科，广东 广州 510655)

目前，糖尿病周围神经痛(diabetic peripheral neuropathy，DPN)的发病机制未明，治疗手段有限[1,2]。临床上极其需要针对DPN的持续且有效的治疗方法。獐牙菜苦苷(Swertiamarin)是中药龙胆草的主要活性成分之一，新近研究表明獐牙菜苦苷可有效保护神经，减缓神经病理性疼痛[3]。但是由于其作用的具体机制尚不明确，影响了其在DPN镇痛领域的应用。本研究基于炎性应激反应层面，旨在研究獐牙菜苦苷对DPN大鼠血清炎性反应的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究经本院动物实验伦理审查。SPF级SD大鼠30只，体质量200～220 g，由中山大学(北校区)动物实验中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2017-0882。实验环境：温度保持在(25±1) ℃，光/暗环境每12 h循环一次，相对湿度为(55±10)%。大鼠颗粒饮食配方：74%碳水化合物、21%蛋白质和4%脂肪。

1.2 动物模型的建立

采用链脲佐菌素(STZ，美国Sigma)腹腔注射法构建DPN大鼠模型。大鼠实验前先适应性喂养1周，开始实验后，禁食12 h，腹腔注射STZ溶液(55 mg/kg)，48 h后测定大鼠尾静脉血糖。血糖>16.7 mmol/L的大鼠为DPN模型组大鼠(经热辐射试验、冷板试验以及触觉过敏试验均证实模型组大鼠存在肢体反应潜伏期缩短、疼痛阈值下降等类似糖尿病周围神经痛的症状)。

1.3 动物分组与处理

采用随机数字表法将30只大鼠分为空白组、DPN组及獐牙菜苦苷组。对DPN组和獐牙菜苦苷组进行DPN造模，造模后第7、14天，獐牙菜苦苷组按大鼠体质量分别给予腹腔注射30 mg/kg獐牙菜苦苷(成都瑞芬思)；空白组与模型组分别腹腔注射30 ml/kg生理盐水。造模后第14天结束实验，所有大鼠麻醉下处死，取血加入抗凝管，离心后取上清液置于-70 ℃保存，用于检测血清促炎因子TNF-α、IL-6 、IL-8以及抑炎因子IL-10、TGF-β的含量水平。

1.4 ELISA检测

根据ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠血清促炎因子TNF-α、IL-6 、IL-8，抑炎因子IL-10、TGF-β的水平。

1.5 RT-PCR检测

按照GenBank序列，用美国Invitrogen公司Vector NTI suite软件核查并修改个别非配对碱基，交上海英俊生物工程公司合成，见表1。按Trizol试剂说明书进行试验，使用美国Media Cybernetics公司Gel-Pro Analyzer 4.0软件，计算待测细胞因子的GAPDH的光密度比值。

1.6 免疫印迹检测

使用蛋白免疫印迹法检测各组大鼠TNF-α、IL-6 、IL-8、IL-10、TGF-β蛋白表达，使用美国Media Cybernetics公司Gel-Pro Analyzer 4.0软件半定量分析。

表1 PCR引物序列及扩增条件

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 血清炎性因子水平比较

DPN组促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白组(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β低于空白组(P<0.05)。獐牙菜苦苷组促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8低于DPN组(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β高于DPN模型组(P<0.05)；獐牙菜苦苷组TGF-β低于空白组(P<0.05)，见图1。

2.2 血清炎性因子mRNA表达水平比较

DPN组促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白组(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β低于空白组(P<0.05)。獐牙菜苦苷组促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8低于DPN组(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β高于DPN组(P<0.05)。獐牙菜苦苷组促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白组(P<0.05)；抑炎因子IL-10低于空白组(P<0.05)，但两组TGF-β比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.3 血清炎性因子蛋白表达水平比较

DPN组促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白组(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β低于空白组(P<0.05)。獐牙菜苦苷组促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8低于DPN组(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β高于DPN模型组(P<0.05)。獐牙菜苦苷组促炎因子TNF-α、IL-6高于空白组(P<0.05)；抑炎因子IL-10低于空白组(P<0.05)，两组IL-8、TGF-β比较，差异无统计学意义，见图3。

注：与DPN组比较，*P<0.05；与空白组比较，#P<0.05

图1 3组大鼠血清炎性因子水平变化

注：与DPN组比较，*P<0.05；与空白组比较，#P<0.05

图2 3组大鼠血清炎性因子mRNA表达水平的比较

注：与DPN组比较，*P<0.05；与空白组比较，#P<0.05

图3 3组大鼠血清炎性因子蛋白水平表达

3 讨论

糖尿病是威胁人类健康的三大慢性代谢性疾病之一，其中DPN发病率13%～26%，且逐年增长。目前，DPN尚无彻底治愈甚至短期控制的有效方法，对患者及社会造成沉重的心理及经济负担[4,5]。炎症反应在DPN的发生发展中发挥了至关重要的作用，有研究结果表明，TNF-α与DPN发病密切相关[6]。TNF-α的上调促进了一系列下游炎症反应，导致神经细胞损伤和脱髓鞘，最终导致周围神经功能障碍。使用TNF-α抑制剂后则减轻了DPN大鼠的神经损伤。除了TNF-α外，还存在许多炎症因素参与DPN的进程，包括IL-6、IL-8、IL-10及TGF-β。我们研究团队既往研究发现，Toll-like受体(Toll-like receptor 4，TLR4)抑制剂TAK-242减少氧化应激、降低血糖水平，对DPN大鼠起治疗作用，其机制是通过调节HGMB1/TLR4/MAPK信号通路，抑制促炎因子，促进抑炎因子表达，纠正免疫紊乱。我们团队前期研究已验证免疫因素在DPN致病中的重要作用[7-10]。

炎性因子按照功能不同分为促炎因子与抗炎因子，促炎因子包括TNF-α、IL-6以及IL-8等，抑炎因子包括IL-10以及TGF-β等。正常生理情况下，促炎因子与抗炎因子互相作用维持机体炎性因子相对平衡[11]。而在病理状态下，促炎因子与抗炎因子的平衡一旦被打破，将诱发炎性活动及炎性级联反应，导致慢性炎症刺激引起神经痛。因此，纠正炎性因子失衡是治疗DPN的新靶点。

獐牙菜苦苷属于新近出现的镇痛药物，现代学者对獐牙菜苦苷的药理作用研究主要集中在镇痛和保肝利胆方面[12]。研究表明獐牙菜苦苷可有效保护神经，减缓病理性神经疼痛[12-13]。其作用机制不明确。令我们关注的是，新近研究表明獐牙菜苦苷可调节NLRP3炎性小体信号通路[14]，这可能是其纠正炎性因子失衡治疗DPN中的分子机制。

本实验旨在研究獐牙菜苦苷对DPN大鼠血清炎性反应的影响。实验采用STZ构建DPN大鼠模型，因为 STZ无神经毒性，适用于糖尿病相关的神经系统并发症的研究。实验通过ELISA、RT-PCR以及免疫印迹三种方法检测血清标本，结果显示DPN模型组促炎因子水平高于空白组、抑炎因子低于空白组，提示在DPN中确实存在炎性因子失衡的状况。而炎性因子失衡将进一步促进炎性级联反应，引起慢性周围神经痛，这可能是DPN的致病因素之一。獐牙菜苦苷组促炎因子低于DPN模型组；抑炎因子均高于DPN模型组。提示獐牙菜苦苷可有效纠正DPN炎性因子失衡的状况，减缓神经病理性疼痛。獐牙菜苦苷组与空白组比较，部分炎性因子有统计学意义。这可能与獐牙菜苦苷干预的剂量和用药持续时间相关，研究小组今后将继续深入研究。

本研究结果表明獐牙菜苦苷可有效纠正DPN炎性因子失衡的状况，减缓神经病理性疼痛。其作用机制可能是通过促进抗炎因子表达，减少促炎因子表达，减少炎性因子级联反应实现的。综合以往研究结果，獐牙菜苦苷可以为DPN提供良好的镇痛、抗炎作用，有望成为治疗DPN的新药物。