富硒蛹虫草对小白鼠急性毒理学实验研究

刘沐欣，赵南南，王泽，徐方旭，柳叶飞，王升厚＊

（1.沈阳师范大学 生命科学学院，辽宁沈阳 110034；2.沈阳师范大学实验教学中心，辽宁沈阳 110034）

蛹虫草又称北虫草、北冬虫夏草，与冬虫夏草同属于麦角菌科，为虫草属的模式菌种，在化学成分上和保健功能上与冬虫夏草相似，具有抗肿瘤、提高免疫力、抗炎、抗氧化以及延缓衰老等作用。目前对蛹虫草人工栽培、化学成分和功效方面研究较多，对于蛹虫草毒性研究较少。本实验采用急性毒理实验对蛹虫草的食用安全性进行评价，以期为蛹虫草的安全食用量提供一定的实验依据，为蛹虫草的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试蛹虫草材料：富硒蛹虫草马氏一号（代号：MS82），人工培育，子实体中硒含量82 mg/kg；普通蛹虫草（代号：PT356），采用自然饮用水灌胃，为辽宁蛹虫草栽培基本配方；空白组，采用自然饮用水灌胃。上述材料全部来源于沈阳师范大学特种菌业研究所，蛹虫草全株使用。45 ℃真空干燥后研磨成粉，80目筛子过筛3次，干燥储存。按实验要求用自然饮用水配制所需浓度的蛹虫草溶液，现配现用。

昆明系SPF级小鼠、体重18～20 g，购自辽宁长生生物技术有限公司。于温度（24±2）℃、湿度55%±5%、自由采食和饮水饲养2～3 d，以适应新的环境。

1.2 实验试剂

谷丙转氨酶（ALT）试剂盒、谷草转氨酶（AST）试剂盒、白蛋白（ALB）试剂盒、尿素氮（BUN）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；PBS缓冲液等。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

将小鼠随机分为空白组、对照组、实验组，每组10只，雌雄各半，用于急性毒理学研究。等量灌胃，空白组：自然饮用水；对照组：普通蛹虫草，按规定配制灌胃悬浊液；实验组：富硒蛹虫草，按规定配制灌胃悬浊液。

1.3.2 急性毒理实验

依据中华人民共和国卫生部2009年3号公告，批准蛹虫草子实体为新资源食品，公告中规定正常成人使用量为2 g/人·d，成人体重按60 kg计，急性毒理实验采用一日给予最大剂量，即人推荐量的100倍剂量。对照组和实验组小鼠的灌胃量为641.0 mg/只，24 h内分两次灌胃给予实验动物，间隔9 h，每次灌胃量为0.5 mL。观察15天，每天观察小鼠的行为、毛发、精神状态等，日记录各组小鼠饮水量、饮食量，每隔3天称量小鼠体重。

1.3.3 解剖观察

急性毒理实验结束后，麻醉小鼠，称量体重。心脏取血，将血液样品收集到1.5 mL离心管中，室温静置 2 h 后，4 ℃，5 000 r/min 离心 5 min，取上清液-80 ℃储存待用。尸检观察器官的变化，迅速解剖肝脏、肾脏、脾、胸腺、胃、肠等脏器，PBS缓冲液中洗涤，在滤纸上吸干后，称重记录，并计算脏器指数，脏器指数=脏器重量（mg）/体重（g）×100%。

1.3.4 小鼠血生化指标检测

根据试剂盒指定实验步骤对小鼠的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）血液生化指标进行检测。每组随机选取5只小鼠血清进行检测，每只小鼠检测3次。实验结果以“平均值±标准差”的形式表示，数据处理及组间显著性采用SPSS20.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠外部形态

如图1所示，在为期15天的急性毒理实验中，随着天数的增加，相较于空白组，实验组小鼠相较于空白组相比，逐渐出现精神低迷、行动迟缓、食欲不振、活动量减少、身体佝偻及毛色偏黄等中毒症状；从第4天起开始出现死亡现象，至实验结束有4只小鼠死亡，空白组及普通组均未出现明显中毒和异常现象。

图1 实验组硒中毒小鼠形态

2.2 体重测定结果

如图2所示，三组小鼠的体重均呈上升的趋势，对照组小鼠的体重略低于空白组（p＞0.05）。实验初期，实验组体重出现降低，随着时间延长，体重增加缓慢，在三组中最低（p＜0.05）。其中，实验组死亡个体体重明显偏轻，显著低于空白组和对照组（p＜0.05），且对照组雄性小鼠体重增加大于雌性，而实验组雄性小鼠的体重均小于雌性小鼠。

图2 急性染毒15天各组小鼠体重变化

2.3 饮水量测定结果

如图3所示，三组小鼠的饮水量均呈上升的趋势，对照组小鼠的饮水量略低于空白组（P＞0.05），实验组小鼠的饮水量最低，显著低于空白组和对照组（P＜0.05）。

图3 急性染毒15天各组小鼠饮水量变化

2.4 饮食量测定结果

如图4所示，随着实验开展，观察发现三组小鼠的饮食量均呈上升的趋势，对照组小鼠的饮食量略低于空白组，不具有显著性差异（p＞0.05），实验组小鼠的饮食量最低，显著低于空白组和对照组（p＜0.05）。空白组和对照组雄性小鼠的饮食量大于雌性小鼠，而实验组雄性小鼠的饮食量小于雌性小鼠。

图4 急性染毒15天各组小鼠饮食量变化

2.5 脏器指数

如表1所示，在肾脏指数、胸腺指数、脾脏指数及胃指数方面，各组之间均无显著性差异（p＞0.05）。此外，对照组与空白组肝脏指数无显著性差异，实验组肝脏指数偏大，与空白组和对照组均存在显著性差异（p＜0.05）。其中，实验组胸腺解剖出现发育不良状况。

表1 蛹虫草对小鼠脏器指数的影响

2.6 血生化指标检测

如表2所示，在AST活力、ALB含量、BUN浓度方面，对照组、实验组小鼠与空白组无显著性差异（p＞0.05）。对各组小鼠ALT活力进行显著性分析，可知对照组小鼠与空白组不存在显著性差异（p＞0.05），实验组小鼠ALT活力与空白组和对照组均存在显著性差异（p＜0.05）。受损，结合脏器指数，说明实验组的蛹虫草对小鼠肝脏有较大的影响和毒性作用。

表2 蛹虫草对小鼠血液生化指标的影响

根据《保健食品检验与技术评价规范》可知，当LD50大于或等于100倍者时（即死亡数量小于或等于一半），可以进入下一阶段毒理学试验，代表实验组蛹虫草满足作为保健食品要求，且之前对该虫草进行了10倍浓度的亚急性毒理学试验检测，可初步确定10倍浓度（20 g/人·d）为安全剂量。

3 结论

急性毒理实验显示，空白组和对照组的蛹虫草对小鼠无明显的影响作用，而实验组的蛹虫草对小鼠具有明显的毒性作用，主要表现为小鼠体重、饮食和饮水量均减少，且雄鼠体重饮食饮水皆低，说明雄性小鼠较雌性小鼠更容易受虫草剂量影响。谷草转氨酶（AST）活力、白蛋白（ALB）含量、尿素氮（BUN）浓度三组无显著性差异，代表肝功能及肾功能基本正常，但是实验组谷丙转氨酶（ALT）的变化，代表肝脏