高表达抗PD-1单克隆抗体细胞株工艺开发的研究

张勇，覃鸿妮，谢钰珍，王倩文

（1.苏州工业园区服务外包职业学院，江苏苏州 215123；2.苏州智享众创孵化管理有限公司，江苏苏州 215123）

程序性死亡受体1（Programmed death 1，PD-1）是一种重要的免疫抑制分子，属于免疫球蛋白超家族[1]。PD-1主要在激活的T细胞和B细胞中表达，功能是抑制细胞的激活，这是免疫系统的一种正常的自稳机制，因为过度的T/B细胞激活会引起自身免疫病，所以PD-1是人体的一道护身符[2-4]。但是，肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体PD-L1和PD-L2，导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活，T细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞[5-7]。PD-1的抗体可以阻断这一通路，部分恢复T细胞的功能，使这些细胞能够继续杀伤肿瘤细胞。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。其配体PD-L1也可作为靶点，相应的抗体也可以起到相同的作用[2]。本研究以PD-1分子为靶点，以中国仓鼠卵巢（CHO）细胞为宿主，构建高表达抗PD-1单克隆抗体的细胞株，优化细胞株筛选工艺，得到稳定高表达PD-1细胞株，且蛋白质量与原研药一致。

1 材料与方法

1.1 试验材料

重组工程细胞株的构建，采用自Invitrogen购入的FreedomTMCHO-STM kit。该试剂盒包含表达载体pFreedomTM CHO1.0和宿主细胞CHO-S。细胞生长过程中使用化学限定培养基CD FortiCHO 培养基，呈悬浮态生长。

1.2 试验方法

1.2.1 目的基因的合成

根据信号肽氨基酸序列得出目的基因序列，设计引物通过PCR方法合成目的基因。

（1）目的信号肽序列及引物序列。

Heavy chain METDTLLLWVLLLWVPGSTG（信号肽）

Light chain METDTLLLWVLLLWVPGSTG（信号肽）

（2）扩增引物序列。

重链 01-H-F：5’-CTTCCTAGGGCCACCATGGGCTG GAGCCTGATCCT-3’

01-H-R：5’-attGTATACTCACTTGCCCAGGGAGAG GCTCA-3’

轻链 01-L-F：5’-CTTGATATCGCCACCATGGATTTT CAGGTGCAAAT-3’

01-L-R：5’-ATTTTAATTAATCAGCATTCGCCCCGA TTAAAGGACTTGG-3’

1.2.2 表达质粒的构建

由Primer软件设计2对特异性引物（本实验所有引物均由苏州金维智生物科技有限公司合成），引物经过1轮PCR扩增，得到H链目的片段，将H链目的片段通过T4连接的方法克隆到经过AvrII和BstZ17I双酶切过的 Freedom ®pCHO 1.0载体上，命名为pCHO1.0-H。引物经过第2轮PCR扩增，得到L链目的片段，将L链目的片段通过T4连接的方法克隆到经过EcoRV 和PacI双酶切过的pCHO1.0-H载体上，命名为pCHO1.0-PD-1。

1.2.3 重组工程细胞株的构建

电转染的方法将抗体表达质粒pCHO1.0-PD-1转入宿主细胞，利用Puromycin和MTX筛选系统对细胞进行加压筛选和克隆化，从而得到高表达PD-1抗体的克隆。通过比较克隆的生长特征及所表达蛋白的性质，最终确定细胞株。重组工程细胞株的构建采用自Invitrogen购入的FreedomTMCHO-STM kit，将转染48小时后的细胞悬液过滤后传代至T75方瓶。所用筛选培养基分别为含有 10 μg/ml Puro、100 nmol/L MTX。将方瓶置于37℃，8% CO2的培养箱中静置培养。7天后开始每3～4天检测细胞活率，当细胞活率大于30%或细胞活率较最近一次检测有所增加时，将细胞以1×106个/ml的密度传代至125 ml摇瓶。当细胞活率大于85%，细胞密度大于1×106个/ml时，第一阶段筛选完成。对第一阶段加压放大得到的3个细胞群和第二阶段加压放大得到的3个细胞群采用6孔板5天静止培养的方法进行高产细胞群的筛选。6孔板5天静止培养方法：以0.3×106个/ml的细胞密度接种至6孔板，接种体积为3 ml，第5天结束，收获上清液。利用生物膜干涉技术检测抗体表达量，筛选出抗体表达量最高的细胞群。

1.2.4 细胞株的鉴定

对表达量最高的2个克隆进行基因组目的基因测序及支原体、无菌检测。并对2个克隆所表达抗体进行理化性质分析。

1.2.4.1 目的基因测序

用 TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒、按照厂家提供的方法，分别提取初步稳定性实验中连续传代至第9代的细胞的基因组DNA，以基因组DNA作为模板，用表中位于目的基因侧翼区的引物进行PCR，分别获得携带全长IBI308重链基因及轻链基因的PCR产物。将PCR产物进行DNA测序。

1.2.4.2 支原体检测及无菌检测

使用支原体PCR检测试剂盒，对2个细胞株进行初步支原体检测。检测方法详见试剂盒说明书。若待测样品存在支原体污染，检测结果应获得290 bp的PCR条带。

1.2.4.3 LC/MS法产品分子量检测

切糖样品处理：样品用 New England Biolabs公司的 PNGase F（P0704S）切糖，取 50 μg样品用超纯水稀释至90 μL，加入10×G7缓冲液（随酶提供）10 μL、PNGase F 2 μL，37 ℃孵育 24 h。孵育后的样品转移至离心浓缩柱中，以13 000 r/min速度离心15 min，再以 1 000×g的速度回收蛋白 3 min 后加 8 mol/L 的盐酸胍 100 μL 和 1 mol/L DTT 3 μL，37 ℃孵育1 h以还原二硫键。然后脱盐并稀释至1 mg/mL，上LC-MS分析。处理的样品采用LC-MS检测。

不切糖轻重链分子量检测样品处理：取样品50 μg至离心浓缩柱中，加水至 500 μL，以 13 000 r/min速度离心 15 min，再以 1 000×g的速度回收蛋白3 min 后加 8 mol/L 的盐酸胍 100 μL 和 1 mol/L DTT 3 μL，37 ℃孵育1 h以还原二硫键。然后脱盐并稀释至 1 mg/mL，上 LC-MS 分析。

1.2.4.4 蛋白SEC纯度（SEC-HPLC法）

用超纯水将样品稀释至2 mg/mL，置于进样瓶中，接上分析柱，设置方法参数为：流速0.5 mL/min，柱温 25 ℃，进样量 50 μL，即蛋白 100 μg，每个样品重复进样2次，检测波长280 nm，分析时间30 min。检测完成后，采用峰面积归一化法计算各样品主成分的百分比。

1.2.4.5 初步传代稳定性检测

复苏原始细胞株进行初步传代稳定性研究。将复苏后细胞连续培养59天（约60个细胞世代）。传代过程中使用添加1% Anti-Clumping Agent、1 000 nmol/L MTX的生长培养基，接种密度为0.3×106～ 0.8×106个 /mL，接种体积为 30 mL。每周一、三、五传代。观察传代过程中2个细胞株的细胞密度、细胞活率和倍增时间。

1.2.4.6 抗体表达量检测

2个原始细胞株连续传代约60世代后，分别对M0（原始细胞）、M1（连续传代一个月）、M2（连续传代两个月）的细胞进行14天流加培养实验，检测蛋白表达量。

2 结果与分析

2.1 抗体表达质粒pCHO1.0-PD-1的构建

采 用AvrII/BstZ17I和EcoRV/PacI对 质 粒pCHO1.0-PD-1进行酶切鉴定，确认酶切位点及质粒片段大小正确。如图1所示，用AvrII/BstZ17I进行双酶切，目的片段大小为 1 400 bp，用 EcoRV/PacI进行双酶切，目的片段大小为750 bp，目的片段大小正确，所以酶切位点及质粒片段大小正确。对最终表达质粒pCHO1.0-PD-1进行目的基因测序分析，对比结果显示与理论序列一致。

图1 Lbcpf1片段PCR扩增电泳图

2.2 高表达PD-1的重组工程细胞株构建

2.2.1 筛选高表达细胞群

对第一阶段加压放大得到的3个细胞群和第二阶段加压放大得到的3个细胞群采用6孔板5天静止培养，收获上清液，利用生物膜干涉技术检测抗体表达量。结果表明：以1（第二轮加压）、2（第二轮加压）二个细胞群抗体表达量较高，分别为20.3 mg/L、25.5 mg/L。

2.2.2 筛选阳性单克隆

利用有限稀释法对表达量最高的细胞群18（10/100～50/1000）进行单克隆筛选，在培养第20天时用利用生物膜干涉技术检测上清内的抗体表达量，表达量最高的分别为19.38 mg/L和18.27 mg/L，最低的为5.76 mg/L。筛选出表达量最高的48个克隆，24孔板培养5天后，最高的表达量分别为19.14 mg/L和 17.75 mg/ L，最低的为 10.72 mg/L。筛选出表达量最高的24个克隆，6孔板培养5天后，将表达量高的前18个克隆扩增培养，进行14天流加培养实验，检测其中的蛋白量，结果如图2，从图中可以看出克隆01C90和01C42的表达量是最高的两个，分别为2 091 mg/L 和 2 028 mg/L。

表1 细胞群静止表达量

图2 14天流加培养蛋白量

2.3 细胞库的鉴定

2.3.1 支原体检测及无菌检测

如图3所示，样品1和样品2在290 bp处无条带出现，而3号阳性对照在290 bp处有明显的条带，所以支原体检测结果为阴性。用滤膜过滤法检测细胞库，无菌检测结果为阴性。

图3 支原体检测

2.3.2 LC/MS法产品分子量检测

采用LC-MS法测定了克隆01C42和01C90的切糖轻重链分子量和不切糖轻重链分子量。检测结果表明：两个克隆的实测分子量无明显差异，均为23 745.0，与理论分子量差异在方法误差范围内。重链未切糖实测分子量无明显差异，均为507 166.2，与含有G0F糖型的理论分子量差异在方法误差范围内，重链切糖实测分子量48 270.9，与理论分子量差异在方法误差范围内。因此认为两个克隆的轻重链分子量相同，且与理论值一致。

2.3.3 蛋白SEC纯度（SEC-HPLC法）

原始细胞库2个原始细胞株所表达抗体的SEC检测结果，结果显示，经Protein A亲和柱纯化后，2个原始细胞株所表达的抗体的SEC纯度均高于98%。说明这2个原始细胞株在抗体SEC纯度上均表现优异。

2.3.4 初步传代稳定性

将复苏后细胞连续培养59天（约60个细胞世代）。60个世代的初步传代过程中2个克隆01C42和01C90的抗体表达量均未降低，倍增时间维持在20～30 h，细胞活率均高于95%。

2个原始细胞株连续传代约60世代后，分别对M0（原始细胞）、M1（连续传代一个月）、M2（连续传代两个月）的细胞进行14天流加实验检测蛋白表达量。表2所示为不同世代的2个细胞株14天累积的抗体表达量。图4为不同世代的2个细胞株在14天流加培养实验中的抗体表达量。

表2 不同世代的原始细胞株抗体表达量

图4 不同世代的原始细胞株抗体表达量

3 讨论与结论

3.1 讨论

运用悬浮细胞CHO表达抗PD-1的抗体，无论从表达上还是稳定性都有着比较强的优势，首先在质粒构建中，将重链和轻链插到同一个载体上，保证了重链和轻链的比例为1∶1，可以实现共表达，轻重链在一个载体上，再同PD-1基因共转染，对后面的基因扩增筛选提供基础。采用悬浮培养，使用化学成分确定的培养基CD培养基化学成分简单，制备方便，能很好的支持重组CHO细胞的生长，进而可以达到高密度培养，可达8×106～10×106vc/mL，批次培养的总细胞密度可达 100×106～ 150×106vc/mL，高密度的生长优势促使细胞粉笔的产量达到一个较高的水平，单纯的批次培养最高表达产量可达1g/L，为后续的工艺降低生产成本，减少下游工艺开发的复杂性，另外悬浮培养对于大规模生产有很大优势，如可连续扩大生产量，有利于细胞与培养基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件（温度、pH、氧气分压和二氧化碳等），培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究，于在连续密封的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会，可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持续维持在对数生长期。单克隆抗体是特异性很强的药物，如果可以很好的解决免疫原性的问题，它应用于肿瘤或其他疾病应比其他药物的副作用低得多。从长远来看，作为治疗用品，有着广阔的前景，从商业的角度来讲，治疗性抗体的市场也将是巨大的，随着基因组学和蛋白组学的发展，越来越多的基因及其相关蛋白的发掘，与肿瘤和其他疾病相关的抗原就成为了治疗性抗体研究的主要靶标，治疗性单抗将在人类疾病治疗中扮演重要角色[8-10]。

3.2 结论

通过构建表达质粒PD-1、细胞转染、加压筛选、有限稀释获得高表达PD-1抗体的单克隆。14天流加培养抗体表达量最高的2个克隆01C42和01C90抗体表达量为2.03 g/L和2.09 g/L。2个亚克隆所携带的目的基因序列与理论序列完全相同，所表达抗体的分子量与理论分子量一致。经protein A亲和柱纯化后的抗体纯度均高于98%，60个世代的初步传代过程中2个克隆的抗体表达量均未降低，倍增时间维持在20～30 h，细胞活率均高于98%。