异烟肼片微生物限度检查法的建立

肖中元，周 玲，杨红涛，陈真文，马 迪

(太极集团西南药业股份有限公司，重庆 400038)

异烟肼，又名雷米封(isoniazid；INH；isonicotinyl hydrazine)；化学名称为：4-吡啶甲酰肼。异烟肼能抑制结核杆菌的生长，抗菌作用强，在试管中0.025～0.05 mg/L的浓度即可抑菌，较高浓度对繁殖期细菌有杀菌作用。临床结果表明，在各型肺结核的进展期、播散期、吸收好转期中均发挥了重要作用[1]；异烟肼片为一线抗结核药物[2-3]。

查阅文献，尚无关于异烟肼片微生物限度检查的相关研究报道。现行《中国药典》药典也未公布具体品种的检查方法，仅在通则中收载了平皿法、薄膜过滤法和最可能数法三种检查方法[4]，根据产品的不同特性，可选择不同的方法进行适用性试验。异烟肼片对部分微生物有抑制作用，因此本文通过薄膜过滤法去除异烟肼对微生物的影响，并对微生物限度检方法查进行了验证，试验结果表明，本方法能有效检测异烟肼片含有微生物的程度。

1 仪器与试液

1.1 仪器

电子天平(龙腾电子 JD500-3型)，pH计(梅特勒托利多S210型)，净化工作台(苏净安泰 VS-1300L-U 型)，LMQ.C型立式灭菌锅(新华牌 LMQ.C型)，生化培养箱(永生仪器 YSEI SHH-250L型)，数显恒温振荡器(上海梅香 SHY-2A型)，电热鼓风干燥箱(永生仪器 YSEI CS101-2ABN型)，微生物限度检查仪(杭州盈天 YT-X303型)。

1.2 样品

异烟肼片(西南药业股份有限公司，批号151101、160101、160102) 。

1.3 试验菌种

黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98003]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]、大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(Staphylcoccus aureus)[CMCC(B) 26003]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]，以上试验菌株均自中国食品药品检定研究院采购。

1.4 对照培养基

胰酪大豆液体对照培养基(批号135026-201401)、胰酪大豆琼脂对照培养基(批号135025-201603)、沙氏葡萄糖琼脂对照培养基(批号135013-201502)、沙氏葡萄糖液体对照培养基(135008-201503)、麦康凯液体对照培养基(批号135030-201602)、麦康凯琼脂对照培养基(135009-201503)均购自中国食品药品检定研究院。

1.5 培养基

培养基均是购自北京奥博星生物技术有限公司的脱水干粉培养基，临用时按其标签说明配制；胰酪大豆琼脂培养基(批号20151216)、胰酪大豆液体培养基(批号20151202)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号20160102 )、沙氏葡萄糖液体培养基(批号20151028)、麦康凯琼脂培养基(批号20170112)、麦康凯液体培养基(批号201605222)。

1.6 试液

稀释剂Ⅰ：0.9% 无菌氯化钠溶液；稀释剂Ⅱ：含0.05%聚山梨酯80的0.9% 无菌氯化钠溶液。

2 方法与结果

2.1 菌悬液制备

分别将铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至胰酪大豆胨液体培养基(TSB)中，置于33℃恒温振荡器培养24 h后取出计数，并用稀释剂Ⅰ稀释成1000 cfu/mL的菌悬液，置于2～8℃备用。将白色念珠菌接种至沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)中，置于25℃恒温振荡器培养48 h后取出计数，并用稀释剂Ⅰ稀释成1000 cfu/mL的菌悬液，置于2～8℃备用。将黑曲霉接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)斜面上，置于25℃生化培养箱培养5天后取出计数，加入3 mL稀释剂Ⅱ将孢子洗脱，并用稀释剂Ⅱ稀释成1000 cfu/mL的孢子悬液，置于2～8℃备用。

2.2 供试液的制备

取供试品2瓶混合，称取10 g至无菌的锥形瓶中，加入稀释剂Ⅰ至100 mL，振摇，使溶解，作为1∶10的供试液，备用。

2.3 计数培养基适用性检查

取新鲜制备的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌悬液0.1 mL，分别接种至胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)及其对照培养基，平行制备2个平皿，置于33℃生化培养箱培养3天。另将上述三种菌悬液分别接种至TSB培养基及其对照培养基中，平行制备2管，置33℃恒温振荡器培养3天。

取新鲜制备的白色念珠菌、黑曲霉菌悬液0.1 mL，分别接种至TSA培养基及其对照培养基，平行制备2个平皿，置于33℃生化培养箱培养5天。另将上述二种菌悬液分别接种至SDA培养基及其对照培养基上，平行制备2个平皿，置于25℃生化培养箱培养5天。

各被检液体培养基管与相对应的对照培养基管比较，试验菌生长良好；各被检固体培养基与相对应的对照培养基管比较，菌落形态、大小均一致，被检培养基与对照培养基菌落平均数比值均在0.5～2.0范围内。结果见表1。

表1 培养基适用性试验结果

试验结果表明：微生物计数用培养基适用性符合检查要求。

2.4 控制菌(大肠埃希菌)培养基适用性检查

2.4.1 液体培养基促生长能力检查

取大肠埃希菌悬液0.1 mL，无菌操作接种至100 mL麦康凯液体培养基和对照培养基中，置于42℃恒温振荡器中培养24 h。结果表明，被检培养基与对照培养基相比试验菌生长良好。

2.4.2 固体培养基促生长能力与指示特性检查

取大肠埃希菌悬液0.1 mL，无菌操作用涂布法分别接种于麦康凯琼脂培养基和对照培养基平板上，置于33℃生化培养箱恒温培养18 h。结果表明，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征一致。

2.4.3 培养基抑制能力检查

取金黄色葡萄球菌悬液0.1 mL，无菌操作接种至100 mL麦康凯液体培养基和对照培养基中，置于33℃生化培养箱恒温培养48 h，无试验菌生长。

上述试验结果表明，控制菌(大肠埃希菌)培养基适用性检查符合要求。

2.5 计数方法适应性试验

根据中国药典通则配置试验组、供试品对照组、菌液组样品，进行适用性试验。

2.5.1 需氧菌总数

①试验组: 分别取供试液10 mL分别加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌悬液0.1 mL，混匀。置于微生物限度检查仪过滤，用100 mL稀释液Ⅰ冲洗，每膜冲洗2次。

②供试品对照组: 取供试液10 mL加入0.1 mL稀释液Ⅰ代替菌液，混匀。置于微生物限度检查仪过滤，用100 mL稀释液Ⅰ冲洗，每膜冲洗2次。

③菌液组: 取稀释液Ⅰ10 mL分别加入与试验组相同的菌悬液0.1 mL，混匀。置于微生物限度检查仪过滤，用100 mL稀释液Ⅰ冲洗，每膜冲洗2次。

通过无菌操作将试验组、供试品对照组、菌液组的滤膜取出，菌面朝上分别贴于TSA培养基上，置于33℃恒温培养72 h，计数。

进行3 次独立的平行试验，计算回收率，应在0.5～2范围内，结果见表2。

回收率=(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/ 菌液对照组菌落数

表2 需氧菌总数计数方法适应性结果

2.5.2 霉菌和酵母菌总数

①试验组: 取供试液10 mL分别加入白色念珠菌、黑曲霉菌悬液0.1 mL，混匀。置于微生物限度检查仪过滤，用100 mL稀释液Ⅰ冲洗，每膜冲洗2次。

②供试品对照组: 取供试液10 mL加入0.1 mL稀释液Ⅰ，混匀。置于微生物限度检查仪过滤，用100 mL稀释液Ⅰ冲洗，每膜冲洗2次。

③菌液组: 取稀释液Ⅰ10 mL分别加入被检菌悬液0.1 mL，混匀。置于微生物限度检查仪过滤，用100 mL稀释液Ⅰ冲洗，每膜冲洗2次。

通过无菌操作将试验组、供试品对照组、菌液组的滤膜取出，菌面朝上分别贴于SDA培养基上，置于25℃恒温培养120 h，计数。

进行3 次独立的平行试验，计算回收率，应在0.5～2范围内，结果见表3。

表3 霉菌和酵母菌总数计数回收率结果

适用性试验结果表明，供试液制备方法及薄膜过滤法计数方法可以用于该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。

2.6 大肠埃希菌检查方法适用性试验

根据中国药典通则配置供试品组、阳性对照组、阴性对照组样品，进行适用性试验。

①供试品组：取1∶10的供试液10 mL置于微生物限度检查仪过滤，用100 mL稀释剂Ⅰ洗涤，抽干，取出滤膜置于

100 mLTSB培养基中，于33℃培养18 h。

②阳性对照组：取1∶10的供试液10 mL置于微生物限度检查仪过滤，用100 mL稀释剂Ⅰ洗涤，抽干，再加0.1 mL大肠埃希菌悬液，抽干，取出滤膜置于100 mL TSB培养基中，于33℃培养18 h。

③阴性对照组：取稀释剂Ⅰ10 mL置于微生物限度检查仪过滤，用100 mL稀释剂Ⅰ洗涤，抽干，取出滤膜置于100 mL TSB培养基中，于33℃培养18 h。

分别取供试品组、阳性对照组、阴性对照组的TSB培养物1 mL接种于100 mL麦康凯液体培养基中，于42℃增菌培养24 h；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，33℃培养18 h，观察结果。

阳性对照检出试验菌(大肠埃希菌)，阴性对照和供试品组无菌生长。结果见表4。

表4 控制菌(大肠埃希菌)检查方法适用性结果

试验结果表明，供试液制备方法及控制菌检查方法可以用于异烟肼片的大肠埃希菌检查。

2.7 样品测定

取三批供试品检查样品的微生物限度，三批样品均符合非无菌药品微生物限度标准控制菌、需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的要求。

3 讨论

微生物限度检查容易受环境中微生物的污染，导致样品检测出现误差。因此，对微生物实验室环境的控制至关重要，并需要对实验室进行日常环境监测。实验操作也必须严格遵循无菌操作的原则。

培养基是微生物的生长基础，因此，培养基要具有良好的质量，其贮藏条件以及制备均需严格控制。

本文按照《中国药典》口服固体制剂通则的要求，建立了异烟肼片的微生物限度检查方法。当采用平皿计数法测定供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数时，仅金黄色葡萄球菌回收率在0.5～2.0范围内，其余各菌回收率均不超过0.4，表明异烟肼片供试液制备方法存在一定的抑菌活性作用。因此，采用薄膜过滤法消除供试品的影响，从而准确测定供试品的控制菌、需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数。